Reversible Inhibitors Arrest ClpP in a Defined Conformational State that Can Be Revoked by ClpX Association

Abstract

Caseinolytic protease P (ClpP) is an important regulator of Staphylococcus aureus pathogenesis. A high-throughput screening for inhibitors of ClpP peptidase activity led to the identification of the first non-covalent binder for this enzyme class. Co-crystallization of the small molecule with S. aureus ClpP revealed a novel binding mode: Because of the rotation of the conserved residue proline 125, ClpP is locked in a defined conformational state, which results in distortion of the catalytic triad and inhibition of the peptidase activity. Based on these structural insights, the molecule was optimized by rational design and virtual screening, resulting in derivatives exceeding the potency of previous ClpP inhibitors. Strikingly, the conformational lock is overturned by binding of ClpX, an associated chaperone that enables proteolysis by substrate unfolding in the ClpXP complex. Thus, regulation of inhibitor binding by associated chaperones is an unexpected mechanism important for ClpP drug development.

Insights into ClpXP proteolysis: heterooligomerization and partial deactivation enhance chaperone affinity and substrate turnover in Listeria monocytogenes

“…11 Recently, the first reversible ClpP inhibitors were reported, which distort the active site catalytic triad through structural rearrangements. 12 However, this inactive state of the ClpP peptidase could be reversed through formation of the ClpXP complex, highlighting the power of conformational control within this dynamic system. ClpXP interaction is mainly mediated by ClpX-loops which bind into hydrophobic clefts located at the ClpP axial surface.…”

Über bisherige Denkweisen hinaus – neue Wirkstoffe zur Überwindung der Antibiotika‐Krise

“…[255,256] Zusammen mit zugehçrigen Chaperonen, wie ClpX, erkennt, entfaltet und baut sie bestimmte Proteinsubstrate ab.G enetische ClpP-Knock-out-Stämme von S. aureus, [257] Listeria monocytogenes [258] und Streptococcus pneumoniae [259] weisen eine geringere Virulenz auf und sind damit weniger infektiçs in Abszess-oder Lungen-Infektionsmodellen in der Maus. [257] Die Inhibition von ClpP konnte dabei durch niedermolekulare Substanzen wie b-Lacton U1, [262] Phenylester AV 170 [263] und Verbindung AV 286 [264] über einen reversiblen wie auch über einen irreversiblen Mechanismus erreicht werden (Abbildung 18). [257] Die Inhibition von ClpP konnte dabei durch niedermolekulare Substanzen wie b-Lacton U1, [262] Phenylester AV 170 [263] und Verbindung AV 286 [264] über einen reversiblen wie auch über einen irreversiblen Mechanismus erreicht werden (Abbildung 18).…”

Blockade der ClpXP‐vermittelten Proteolyse mit maßgeschneiderten Peptid‐Phenylestern durch den ungewöhnlichen Zerfall in eine Heptamer‐Hexamer‐Anordnung

“…ClpX 6 erkennt die Substratproteine und entfaltet sie,s odass sie anschließend durch ClpP 14 abgebaut werden kçnnen. [8] Irreversible b-Lacton-Inhibitoren sind nur eingeschränkt stabil, konnten jedoch wirksam die bakterielle Virulenz reduzieren. [3][4][5][6][7] Reversible Oxazol-Inhibitoren zeichnen sich durch eine ausgezeichnete Wirksamkeit gegen die Peptidaseaktivitätvon ClpP aus,jedoch werden sie durch konformative Selektion während der ClpX-Bindung verdrängt, weshalb ClpXP nicht inhibiert werden kann.…”

“…[12] Anhand der ersten Generation von acht N-terminal modifizierten Tmo-Phenylestern konnte die zuvor beschriebene Stereopräferenz von ClpP bestätigt werden, d. h.,( R)-Phe-nylester waren generell bessere Inhibitoren als die entsprechenden (S)-Enantiomere (Abbildung 1b). [8,10] Ausd iesem Grund wurde bei der weiteren Evaluierung der Inhibitoren der Fokus auf das biologisch relevantere ClpXP-Proteasesystem gelegt. (R)-Boc-Tmo-OAr (9)h at einen apparenten IC 50 -Wert von 0.37 mm im Protease-Assay und ist somit der wirksamste bekannte ClpXP-Inhibitor.D as entsprechende (S)-Enantiomer 10 ist dagegen ein 25-fach schlechterer Binder (Abbildung 1c), der das Protein im Acyl-Enzym-Zustand arretiert (Abbildung S2 a-d).…”