Relationship between anIn Vitroand Greenhouse Assay for Biological Control ofBipolaris sorokiniana-Induced Seedling Blight of Wheat
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Antagonismo y efecto biocontrolador de <i>Trichoderma</i> spp. sobre <i>Drechslera teres</i>, agente causal de la "mancha en red" de la cebada (<i>Hordeum vulgare</i> L. var. <i>vulgare</i>)
La Argentina es el mayor productor de cebada destinada a la industria maltera de Sudamérica, llegando en el año 2015 a 3,4 millones de toneladas. Entre las enfermedades más importantes que afectan el cultivo de cebada se encuentra la “mancha en red”, causada por el patógeno fúngico Drechslera teres. Esta enfermedad produce pérdidas en promedio del 20%, afectando el peso y número de granos y la calidad de malta para la elaboración de cerveza. El patógeno D. teres sobrevive de una temporada a la siguiente en los restos culturales de la campaña anterior y en semillas infectadas, siendo estos sus principales fuentes de inóculo. Es por ello que es necesario priorizar su manejo para evitar su propagación y dispersión. En el marco del manejo integrado de enfermedades, el biocontrol, mediado por microorganismos con propiedades antagonistas, es una medida tendiente a disminuir la carga inicial de inóculo permitiendo niveles tolerables de enfermedad. Este manejo conlleva a una disminución en las aplicaciones y dosis de fungicidas químicos, lo que reduce la contaminación y la generación de resistencia de los agentes fitopatógenos. El objetivo de la presente tesis fue realizar estudios de biocontrol sobre el patógeno D. teres con aislamientos nativos de Trichoderma spp. en el marco de la búsqueda de estrategias sustentables para el control de la “mancha en red” en la Argentina. Para esto se plantearon los siguientes objetivos específicos: 1)- Aislar cepas de Trichoderma spp. y de D. teres provenientes de distintas áreas productora de cebada de la Argentina . 2)- Caracterizar morfológica y molecularmente los aislamientos 3)- Analizar la interacción de ambos microorganismos in vitro e identificar los mecanismos biológicos y bioquímicos que intervienen en dicha interacción. 4)- Evaluar el efecto de Trichoderma spp. en ensayos in vivo y determinar su eficiencia como biocontrolador de D. teres. El patógeno D. teres se aisló de hojas de cebada con el síntoma típico de “mancha en red” provenientes de cultivos de la Estación Experimental Julio Hirschhorn (Los Hornos, Buenos Aires) y de semillas infectadas naturalmente de diferentes regiones productoras de cebada de la provincia de Buenos Aires: Barrow, Bolívar, Bordenave y Tres Arroyos. Trichoderma spp. se aisló a partir de muestras de rizósfera del mismo origen que las semillas de cebada. Se seleccionaron 3 cepas de D. teres (D. teres A; D. teres C y D. teres M) y 8 de Trichoderma spp. (T0, T2, T3, T4, T7, T8, T9 y T10) que se caracterizaron morfoculturalmente y filogenéticamente. El análisis molecular se realizó con el marcador ITS para D. teres y Tef1 para Trichoderma spp. Los análisis confirmaron la identidad del patógeno, mientras que para el agente antagonista, permitieron diferenciar los aislamientos obtenidos en dos grupos taxonómicos: siete de ellos (T2, T3, T4, T7, T8, T9 y T10) se agruparon dentro del complejo de especies T. harzianum y uno (T0) dentro del clado T. longibrachiatum. Se evaluó la capacidad antagónica in vitro de los 8 aislamientos de Trichoderma frente al patógeno D. teres. Para esto se realizaron cultivos duales en los que se registró el porcentaje de inhibición miceliar del patógeno y se realizaron observaciones de la zona de interacción mediante microscopía óptica y microscopía de fluorescencia confocal. Durante la confrontación en los cultivos duales, se observó que D. teres produce una pigmentación rojo-anaranjada en la zona de interacción con Trichoderma spp. Se procedió a la extracción y caracterización de los pigmentos mediante medidas de absorbancia en el espectro UV-visible, espectrofluorometría y cromatografía en capa fina (TLC). Además, los pigmentos fueron purificados por Cromatografía Líquida de Alta Performance (HPLC) y se analizaron mediante Resonancia Magnética Nuclear (NMR) para determinar sus identidades. Las observaciones en los cultivos duales mostraron que todos los aislamientos de Trichoderma spp. inhibieron el crecimiento micelial de D. teres en un rango del 18% al 54%. El aislamiento T3 fue el que mejor inhibición produjo con un MGI del 39% al 54%. La pigmentación observada en la zona de contacto de ambos microorganismos se presentó solo durante la confrontación y mostró propiedades fungistáticas. Los mecanismos antagónicos observados microscópicamente en la zona de interacción fueron: micoparasitismo con enrollamiento (coiling), micelio vacuolizado, paredes delgadas sin pigmentación característica (hifas albinas) y micelio deformado. Bajo microscopía confocal se observó autofluorescencia en vesículas citoplasmáticas de D. teres durante la confrontación con Trichoderma spp., sin embargo esta fluorescencia no se evidenció en los cultivos monoespecíficos. A partir de la extracción del pigmento rojo-anaranjado formado durante la interacción D. teres- Trichoderma spp. y del análisis de su espectro UV- visible, se obtuvieron 4 picos de absorbancia de 489, 279, 254 y 230 nm. El espectro de absorción del pigmento observado coincidió según la bibliografía con un tipo de catenarina. Con la técnica de TLC se obtuvieron tres bandas de pigmento, sugiriendo que al menos tres son los pigmentos observados en D. teres durante la confrontación. La coincidencia de los espectros de emisión a 488 nm obtenidos por microscopía confocal y espectrofluorometría indicaron que los pigmentos rojo-anaranjados de la zona de interacción serían los que están presentes en las vesículas citoplasmáticas de D. teres. La comparación de los cromatogramas obtenidos por HPLC de los pigmentos de la zona de interacción y de un estándar de catenarina comercial (1,4,6,8-tetrahidroxi-3-metilantraquinona) resultaron ser muy similares, mostrando además un alto grado de correspondencia en sus espectros NMR. Todo esto sugiere que al menos uno de los compuestos generados por D. teres durante la interacción sería 1,4,6,8-tetrahidroxi-3-metilantraquinona. Se evaluó la capacidad antagónica de Trichoderma spp. sobre D. teres mediada por compuestos orgánicos volátiles (VOCs) con la técnica de cultivos enfrentados a través de la estimación del MGI del patógeno. Los VOCs liberados por los microorganismos solos y en confrontación se extrajeron mediante la técnica “espacio de cabeza” (HS) y los análisis se realizaron por Cromatografía Gaseosa (CG) y Espectrometría de Masas (MS). La evaluación del MGI mediante la liberación de VOCs por Trichoderma spp. evidenció que todos los aislamientos inhibieron entre 19% y 38% el crecimiento de D. teres, siendo T3 el que presentó mayor porcentaje de MGI, coincidiendo con los resultados para cultivos duales. Se observó albinización en las colonias de D. teres expuestas a los VOCs y sus observaciones microscópicas evidenciaron vacuolización, micelio debilitado y paredes muy finas con respecto a lo observado en los testigos. En el análisis de los perfiles CG-MS de VOCs liberados por los cultivos monoespecíficos de Trichoderma spp. se observó una composición similar entre ellos y al encontrado durante la confrontación con D. teres aunque con algunas modificaciones. De ellos, el mayor porcentaje de los compuestos lo representaron los sesquiterpenos, diterpenos y terpenoides. El aislamiento T0 fue el que produjo mayor abundancia relativa solo y en la confrontación con D. teres. También se observó que la presencia del patógeno estimuló la producción de VOCs en los antagonistas. Se evaluaron los aislamientos de Trichoderma spp. probados in vitro, en ensayos de invernáculo mediante sus efectos sobre el biocontrol de D. teres y como promotor del crecimiento. Se realizaron ensayos en sustrato estéril (vermiculita) con el fin de seleccionar los mejores aislamientos para ser probados en tierra. Se emplearon semillas de cebada con 30% de infección natural de D. teres, la cual fue considerada escasa por lo que a su vez fueron inoculadas artificialmente con el aislamiento D. teres A. Trichoderma spp se inoculó 24 h. antes de la siembra. Cada tratamiento consistió en semillas de cebada infectadas artificialmente con el patógeno más el aislamiento de Trichoderma spp. a testear. Las variables evaluadas fueron: incidencia (%), severidad en hojas y tallos (%), clorofila (SPAD), peso seco aéreo y radicular (mg). Los ensayos en tierra se realizaron con los aislamientos T0, T2, T3 y T9 que mostraron mayores habilidades antagonistas en cultivo in vitro e in vivo. Todos los aislamientos probados disminuyeron significativamente el porcentaje de incidencia hasta un 53%. La severidad del tallo disminuyó hasta un 77%, siendo los aislamientos más destacados T2, T3 y T9. La severidad en hoja fue disminuida hasta un 70% siendo T0, y T3 los que mostraron menores valores. En cuanto a la variable clorofila, todos los aislamientos presentaron una tendencia hacia valores más altos que el testigo destacándose T0. Para las variables peso seco aéreo y radicular T0 y T3 fueron los que presentaron mayores valores. Con estos datos, se encontró una clara tendencia en la capacidad diferencial de biocontrol entre los aislamientos de Trichoderma spp. que se correspondió con los ensayos in vitro. Esta investigación permitió contribuir al conocimiento de los mecanismos biológicos que intervienen en la interacción D. teres-Trichoderma spp. aún no abordada en la Argentina, para ser aplicados en potenciales prácticas de biocontrol de enfermedades. Se registró por primera vez la producción del pigmento catenarina generado por D. teres durante la interacción con Trichoderma spp. Se determinó que algunos de los aislamientos de Trichoderma spp. probados in vitro, ejercieron control in vivo mediante la disminución de la transmisión del patógeno de semilla a plántula y de la severidad de la enfermedad. Además, se evidenció que Trichoderma mostró una tendencia hacia la promoción del crecimiento y vigorización de las plántulas de cebada, lo que posiblemente confiere ventajas a las plantas y minimiza el impacto negativo causado por factores bióticos y abióticos.
Antagonismo y efecto biocontrolador de <i>Trichoderma</i> spp. sobre <i>Drechslera teres</i>, agente causal de la "mancha en red" de la cebada (<i>Hordeum vulgare</i> L. var. <i>vulgare</i>)
La Argentina es el mayor productor de cebada destinada a la industria maltera de Sudamérica, llegando en el año 2015 a 3,4 millones de toneladas. Entre las enfermedades más importantes que afectan el cultivo de cebada se encuentra la “mancha en red”, causada por el patógeno fúngico Drechslera teres. Esta enfermedad produce pérdidas en promedio del 20%, afectando el peso y número de granos y la calidad de malta para la elaboración de cerveza. El patógeno D. teres sobrevive de una temporada a la siguiente en los restos culturales de la campaña anterior y en semillas infectadas, siendo estos sus principales fuentes de inóculo. Es por ello que es necesario priorizar su manejo para evitar su propagación y dispersión. En el marco del manejo integrado de enfermedades, el biocontrol, mediado por microorganismos con propiedades antagonistas, es una medida tendiente a disminuir la carga inicial de inóculo permitiendo niveles tolerables de enfermedad. Este manejo conlleva a una disminución en las aplicaciones y dosis de fungicidas químicos, lo que reduce la contaminación y la generación de resistencia de los agentes fitopatógenos. El objetivo de la presente tesis fue realizar estudios de biocontrol sobre el patógeno D. teres con aislamientos nativos de Trichoderma spp. en el marco de la búsqueda de estrategias sustentables para el control de la “mancha en red” en la Argentina. Para esto se plantearon los siguientes objetivos específicos: 1)- Aislar cepas de Trichoderma spp. y de D. teres provenientes de distintas áreas productora de cebada de la Argentina . 2)- Caracterizar morfológica y molecularmente los aislamientos 3)- Analizar la interacción de ambos microorganismos in vitro e identificar los mecanismos biológicos y bioquímicos que intervienen en dicha interacción. 4)- Evaluar el efecto de Trichoderma spp. en ensayos in vivo y determinar su eficiencia como biocontrolador de D. teres. El patógeno D. teres se aisló de hojas de cebada con el síntoma típico de “mancha en red” provenientes de cultivos de la Estación Experimental Julio Hirschhorn (Los Hornos, Buenos Aires) y de semillas infectadas naturalmente de diferentes regiones productoras de cebada de la provincia de Buenos Aires: Barrow, Bolívar, Bordenave y Tres Arroyos. Trichoderma spp. se aisló a partir de muestras de rizósfera del mismo origen que las semillas de cebada. Se seleccionaron 3 cepas de D. teres (D. teres A; D. teres C y D. teres M) y 8 de Trichoderma spp. (T0, T2, T3, T4, T7, T8, T9 y T10) que se caracterizaron morfoculturalmente y filogenéticamente. El análisis molecular se realizó con el marcador ITS para D. teres y Tef1 para Trichoderma spp. Los análisis confirmaron la identidad del patógeno, mientras que para el agente antagonista, permitieron diferenciar los aislamientos obtenidos en dos grupos taxonómicos: siete de ellos (T2, T3, T4, T7, T8, T9 y T10) se agruparon dentro del complejo de especies T. harzianum y uno (T0) dentro del clado T. longibrachiatum. Se evaluó la capacidad antagónica in vitro de los 8 aislamientos de Trichoderma frente al patógeno D. teres. Para esto se realizaron cultivos duales en los que se registró el porcentaje de inhibición miceliar del patógeno y se realizaron observaciones de la zona de interacción mediante microscopía óptica y microscopía de fluorescencia confocal. Durante la confrontación en los cultivos duales, se observó que D. teres produce una pigmentación rojo-anaranjada en la zona de interacción con Trichoderma spp. Se procedió a la extracción y caracterización de los pigmentos mediante medidas de absorbancia en el espectro UV-visible, espectrofluorometría y cromatografía en capa fina (TLC). Además, los pigmentos fueron purificados por Cromatografía Líquida de Alta Performance (HPLC) y se analizaron mediante Resonancia Magnética Nuclear (NMR) para determinar sus identidades. Las observaciones en los cultivos duales mostraron que todos los aislamientos de Trichoderma spp. inhibieron el crecimiento micelial de D. teres en un rango del 18% al 54%. El aislamiento T3 fue el que mejor inhibición produjo con un MGI del 39% al 54%. La pigmentación observada en la zona de contacto de ambos microorganismos se presentó solo durante la confrontación y mostró propiedades fungistáticas. Los mecanismos antagónicos observados microscópicamente en la zona de interacción fueron: micoparasitismo con enrollamiento (coiling), micelio vacuolizado, paredes delgadas sin pigmentación característica (hifas albinas) y micelio deformado. Bajo microscopía confocal se observó autofluorescencia en vesículas citoplasmáticas de D. teres durante la confrontación con Trichoderma spp., sin embargo esta fluorescencia no se evidenció en los cultivos monoespecíficos. A partir de la extracción del pigmento rojo-anaranjado formado durante la interacción D. teres- Trichoderma spp. y del análisis de su espectro UV- visible, se obtuvieron 4 picos de absorbancia de 489, 279, 254 y 230 nm. El espectro de absorción del pigmento observado coincidió según la bibliografía con un tipo de catenarina. Con la técnica de TLC se obtuvieron tres bandas de pigmento, sugiriendo que al menos tres son los pigmentos observados en D. teres durante la confrontación. La coincidencia de los espectros de emisión a 488 nm obtenidos por microscopía confocal y espectrofluorometría indicaron que los pigmentos rojo-anaranjados de la zona de interacción serían los que están presentes en las vesículas citoplasmáticas de D. teres. La comparación de los cromatogramas obtenidos por HPLC de los pigmentos de la zona de interacción y de un estándar de catenarina comercial (1,4,6,8-tetrahidroxi-3-metilantraquinona) resultaron ser muy similares, mostrando además un alto grado de correspondencia en sus espectros NMR. Todo esto sugiere que al menos uno de los compuestos generados por D. teres durante la interacción sería 1,4,6,8-tetrahidroxi-3-metilantraquinona. Se evaluó la capacidad antagónica de Trichoderma spp. sobre D. teres mediada por compuestos orgánicos volátiles (VOCs) con la técnica de cultivos enfrentados a través de la estimación del MGI del patógeno. Los VOCs liberados por los microorganismos solos y en confrontación se extrajeron mediante la técnica “espacio de cabeza” (HS) y los análisis se realizaron por Cromatografía Gaseosa (CG) y Espectrometría de Masas (MS). La evaluación del MGI mediante la liberación de VOCs por Trichoderma spp. evidenció que todos los aislamientos inhibieron entre 19% y 38% el crecimiento de D. teres, siendo T3 el que presentó mayor porcentaje de MGI, coincidiendo con los resultados para cultivos duales. Se observó albinización en las colonias de D. teres expuestas a los VOCs y sus observaciones microscópicas evidenciaron vacuolización, micelio debilitado y paredes muy finas con respecto a lo observado en los testigos. En el análisis de los perfiles CG-MS de VOCs liberados por los cultivos monoespecíficos de Trichoderma spp. se observó una composición similar entre ellos y al encontrado durante la confrontación con D. teres aunque con algunas modificaciones. De ellos, el mayor porcentaje de los compuestos lo representaron los sesquiterpenos, diterpenos y terpenoides. El aislamiento T0 fue el que produjo mayor abundancia relativa solo y en la confrontación con D. teres. También se observó que la presencia del patógeno estimuló la producción de VOCs en los antagonistas. Se evaluaron los aislamientos de Trichoderma spp. probados in vitro, en ensayos de invernáculo mediante sus efectos sobre el biocontrol de D. teres y como promotor del crecimiento. Se realizaron ensayos en sustrato estéril (vermiculita) con el fin de seleccionar los mejores aislamientos para ser probados en tierra. Se emplearon semillas de cebada con 30% de infección natural de D. teres, la cual fue considerada escasa por lo que a su vez fueron inoculadas artificialmente con el aislamiento D. teres A. Trichoderma spp se inoculó 24 h. antes de la siembra. Cada tratamiento consistió en semillas de cebada infectadas artificialmente con el patógeno más el aislamiento de Trichoderma spp. a testear. Las variables evaluadas fueron: incidencia (%), severidad en hojas y tallos (%), clorofila (SPAD), peso seco aéreo y radicular (mg). Los ensayos en tierra se realizaron con los aislamientos T0, T2, T3 y T9 que mostraron mayores habilidades antagonistas en cultivo in vitro e in vivo. Todos los aislamientos probados disminuyeron significativamente el porcentaje de incidencia hasta un 53%. La severidad del tallo disminuyó hasta un 77%, siendo los aislamientos más destacados T2, T3 y T9. La severidad en hoja fue disminuida hasta un 70% siendo T0, y T3 los que mostraron menores valores. En cuanto a la variable clorofila, todos los aislamientos presentaron una tendencia hacia valores más altos que el testigo destacándose T0. Para las variables peso seco aéreo y radicular T0 y T3 fueron los que presentaron mayores valores. Con estos datos, se encontró una clara tendencia en la capacidad diferencial de biocontrol entre los aislamientos de Trichoderma spp. que se correspondió con los ensayos in vitro. Esta investigación permitió contribuir al conocimiento de los mecanismos biológicos que intervienen en la interacción D. teres-Trichoderma spp. aún no abordada en la Argentina, para ser aplicados en potenciales prácticas de biocontrol de enfermedades. Se registró por primera vez la producción del pigmento catenarina generado por D. teres durante la interacción con Trichoderma spp. Se determinó que algunos de los aislamientos de Trichoderma spp. probados in vitro, ejercieron control in vivo mediante la disminución de la transmisión del patógeno de semilla a plántula y de la severidad de la enfermedad. Además, se evidenció que Trichoderma mostró una tendencia hacia la promoción del crecimiento y vigorización de las plántulas de cebada, lo que posiblemente confiere ventajas a las plantas y minimiza el impacto negativo causado por factores bióticos y abióticos.
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