Tandan kosong kelapa sawit (TKKS) merupakan salah satu biomassa lignoselulosa dengan komposisi utama terdiri atas selulosa, hemiselulosa, dan lignin. Pemisahan komponen lignoselulosa dapat dilakukan dengan fraksionasi melalui metode organosolv. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan kondisi operasi dari proses fraksionasi biomassa lignoselulosa TKKS dengan metode organosolv berkatalis NH4OH. Penelitian dirancang menggunakan Metode Placket-Burman dengan variasi rasio fraksi berat, rasio etanol:air, temperatur, konsentrasi katalis, dan waktu. Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksionasi dapat dilakukan dengan baik pada rasio fraksi berat biomassa 10%, perbandingan etanol:air sebanyak 1:1, temperatur 160°C, dan konsentrasi katalis 5% NH4OH, selama 120 menit. Kondisi tersebut dapat menghasilkan perolehan selulosa 98,07%, perolehan hemiselulosa 98,71% dan penghilangan lignin 60,28%. Penggunaan kembali pelarut dilakukan dengan memisahkan lignin melalui presipitasi H2SO4 1M pada pH 2. Penggunaan pelarut untuk kedua kali dapat menghasilkan perolehan selulosa 98,03%, perolehan hemiselulosa 65,61% dan penghilangan lignin 59,81%. Sementara itu, dari perhitungan neraca massa, dapat dilihat bahwa proses tersebut dapat dilakukan karena kehilangan pelarut dan padatan relatif sedikit. Kehilangan padatan berkisar pada 19,06% dari umpan TKKS, sedangkan pelarut yang dapat diambil adalah sekitar 59,34% dari umpan etanol.