Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan Lembar Kerja Mahasiswa berbasis Eksperimen materi enzim mikroba yang valid untuk bahan ajar bioteknologi mikroba. Pengembangan Lembar Keja Mahasiswa (LKM) mneggunakan Model 4D memiliki 4 tahapan, yaitu define, design, develop, dan disseminate. Pada penelitian ini hanya terbatas pada tahap develop. Analisis data menggunakan statistic deskriptif untuk menentukan kriteria kevalidan sebuah produk yang dikumpulkan melalui lembar penilaian yang diisi oleh validator. LKM berbasis eksperimen materi enzim mikroba yang dikembangkan dengan model 4D memiliki kriteria valid untuk menjadi bagian dari bahan ajar bioteknologi mikroba. Hasil penelitian menunjukkan bahwa validasi dari ahli materi kategori valid dengan nilai persentase 88,33%, validasi dari ahli media dengan persentase 85,83% dengan kategori valid dan ahli bahasa dengan persentase 76,67% dengan kategori valid dan uji keterbacaan oleh mahasiswa dengan nilai persentase 84,50% dengan kategori valid. Kesimpulan dari penelitian ini bahwa LKM berbasis eksperimen materi enzim mikroba yang dikembangkan valid untuk bahan ajar bioteknologi mikroba.