Paxillin LD4 Motif Binds PAK and PIX through a Novel 95-kD Ankyrin Repeat, ARF–GAP Protein: A Role in Cytoskeletal Remodeling

Abstract

Paxillin is a focal adhesion adaptor protein involved in the integration of growth factor- and adhesion-mediated signal transduction pathways. Repeats of a leucine-rich sequence named paxillin LD motifs (Brown M.C., M.S. Curtis, and C.E. Turner. 1998. Nature Struct. Biol. 5:677–678) have been implicated in paxillin binding to focal adhesion kinase (FAK) and vinculin. Here we demonstrate that the individual paxillin LD motifs function as discrete and selective protein binding interfaces. A novel scaffolding function is described for paxillin LD4 in the binding of a complex of proteins containing active p21 GTPase–activated kinase (PAK), Nck, and the guanine nucleotide exchange factor, PIX. The association of this complex with paxillin is mediated by a new 95-kD protein, p95PKL (paxillin-kinase linker), which binds directly to paxillin LD4 and PIX. This protein complex also binds to Hic-5, suggesting a conservation of LD function across the paxillin superfamily. Cloning of p95PKL revealed a multidomain protein containing an NH2-terminal ARF–GAP domain, three ankyrin-like repeats, a potential calcium-binding EF hand, calmodulin-binding IQ motifs, a myosin homology domain, and two paxillin-binding subdomains (PBS). Green fluorescent protein- (GFP-) tagged p95PKL localized to focal adhesions/complexes in CHO.K1 cells. Overexpression in neuroblastoma cells of a paxillin LD4 deletion mutant inhibited lamellipodia formation in response to insulin-like growth fac- tor-1. Microinjection of GST–LD4 into NIH3T3 cells significantly decreased cell migration into a wound. These data implicate paxillin as a mediator of p21 GTPase–regulated actin cytoskeletal reorganization through the recruitment to nascent focal adhesion structures of an active PAK/PIX complex potentially via interactions with p95PKL.

Nek3 kinase regulates prolactin-mediated cytoskeletal reorganization and motility of breast cancer cells

“…Rac1 activity is regulated by GEFs and Rho GTPase-activating proteins (GAPs), and Vav2 has been shown to stimulate membrane ruffling and motility when overexpressed (Liu and Burridge, 2000;Marignani and Carpenter, 2001). Additional pathways leading to Rac1 activation also involve paxillin, as paxillin has been shown to participate in the targeting of active Rac1 to the membrane via an interaction with PKL, an ARF-GAP (Turner et al, 1999;Kondo et al, 2000). Thus, Nek3 contributes to the PRL-mediated phosphorylation of both Vav2 and paxillin and may regulate Rac1 activity through pathways involving both proteins, in a manner that will require additional study.…”

Le complexe GIT-PIX : Une plate-forme de régulation des GTPases ARF et Rac/Cdc42

“…À ce jour, ces locus n'ont pas été associés à des maladies. Tandis que GIT1 semble être uniquement exprimé sous sa forme longue (761 à 770 acides aminés selon l'espèce), GIT2 présente un épissage alternatif important produisant une forme courte et une forme longue [9,10]. Le domaine fonctionnel le plus caractéristique des protéi-nes GIT est le domaine GAP pour les GTPases de la famille ARF (Figure 1).…”

“…On retrouve ensuite un domaine coiled-coil qui permet une dimérisation des protéines GIT [16]. Finalement, deux autres domaines de liaison au domaine LD4 de la paxilline (PBS, paxillin binding site) ont été identifiés [10,17]. La première fonction cellulaire identifiée de GIT1 est son rôle dans le recyclage de certains récepteurs couplés aux protéines G hétérotrimériques (RCPG) qui utilisent la voie d'endocytose par puits de clathrine, mais également dans celui d'autres récepteurs tels que le récepteur de l'EGF (epidermal growth factor) [9,18].…”

“…De nombreuses études ont montré l'existence de complexes protéiques impliquant les protéines GIT, PIX et PAK dans des lignées cellulaires et des tissus de natures variées [9,10,15,20]. Ceux-ci peuvent contenir GIT1 ou GIT2, αPIX ou βPIX et PAK1 ou PAK2 ou PAK3.…”

“…Les protéines GIT et PIX ayant des localisations subcellulaires diversifiées et discrètes (contacts focaux, jonctions cellulaires), le complexe PIX-GIT présent dans un compartiment subcellulaire donné, pourrait, tel un aiguillage, induire le changement d'une voie de signalisation ARF-dépendante vers une voie dépendante de Rac/Cdc42 (Figure 2). À ce jour, la plupart des études se fondent sur le modèle d'une interaction GIT-PIX qui serait régulée et assument donc que les deux protéines se dissocient pour jouer leurs rôles de façon indépendante [10,14,20]. Cependant, une étude récente démontre l'existence d'un complexe oligomérique très stable constitué des protéines GIT et PIX [16].…”