Optimized PCR Conditions and Increased shRNA Fold Representation Improve Reproducibility of Pooled shRNA Screens

Abstract

RNAi screening using pooled shRNA libraries is a valuable tool for identifying genetic regulators of biological processes. However, for a successful pooled shRNA screen, it is imperative to thoroughly optimize experimental conditions to obtain reproducible data. Here we performed viability screens with a library of ∼10 000 shRNAs at two different fold representations (100- and 500-fold at transduction) and report the reproducibility of shRNA abundance changes between screening replicates determined by microarray and next generation sequencing analyses. We show that the technical reproducibility between PCR replicates from a pooled screen can be drastically improved by ensuring that PCR amplification steps are kept within the exponential phase and by using an amount of genomic DNA input in the reaction that maintains the average template copies per shRNA used during library transduction. Using these optimized PCR conditions, we then show that higher reproducibility of biological replicates is obtained by both microarray and next generation sequencing when screening with higher average shRNA fold representation. shRNAs that change abundance reproducibly in biological replicates (primary hits) are identified from screens performed with both 100- and 500-fold shRNA representation, however a higher percentage of primary hit overlap between screening replicates is obtained from 500-fold shRNA representation screens. While strong hits with larger changes in relative abundance were generally identified in both screens, hits with smaller changes were identified only in the screens performed with the higher shRNA fold representation at transduction.

Triagem funcional de genes envolvidos no processo de manutenção da inativação do cromossomo X em humanos

“…Entretanto, para que a triagem funcional seja bem sucedida, é imperativo que as condições experimentais sejam cuidadosamente otimizadas. Diversos fatores que exercem influência sob cada um dos passos experimentais adotados podem afetar a qualidade da triagem e a significância biológica dos resultados obtidos (Sims et al, 2011;Strezoska et al, 2012). Sendo assim, cada um dos passos experimentais envolvidos em nossa triagem funcional foi cuidadosamente otimizado antes que nossas amostras pudessem ser submetidas ao NGS.…”

“…Isso porque, quanto maior a representatividade da biblioteca, maior a reproducibilidade do experimento de triagem e menor a quantidade de candidatos falsos negativos e falsos positivos obtidos (Sims et al, 2011;Strezoska et al, 2012). A escolha da uma linhagem celular altamente permissiva à transdução por partículas lentivirais, a seleção da melhor versão da biblioteca de shRNAs para uso no modelo celular escolhido e a determinação da quantidade de partículas lentivirais a ser utilizada durante a transdução das células-alvo com a biblioteca de shRNAs foram aspectos cuidadosamente avaliados em nosso trabalho através de uma série de experimentos preliminares de transdução realizados em fibroblastos humanos primários que incluiu também a própria linhagem celular alvo GM1661.…”

“…O número de células submetidas à transdução com a biblioteca de shRNAs também afeta a taxa de representação dos diferentes tipos de shRNAs durante a triagem funcional e é provavelmente um dos fatores mais críticos para que uma boa representatividade da biblioteca seja adquirida (Sims et al, 2011;Strezoska et al, 2012 Alguns trabalhos foram desenvolvidos de forma a obter dez cópias de cada inserto na amostra inicial, enquanto outros almejaram obter mil cópias (Huang et al, 2008;Schlabachet al, 2008;Hurov et al, 2010;Mendes-Pereira et al, 201). Entretanto, a complexidade da biblioteca de shRNAs também influencia na determinação do número de células a serem utilizadas.…”

“…Além disso, o número de cópias por inserto a ser utilizado depende também da estratégia experimental. Experimentos que, como o descrito nessa tese, visam identificar shRNAs enriquecidos após a aplicação de uma pressão seletiva tendem a ser menos estringentes do que experimentos que visam identificar shRNAs que foram depletados da amostra (Strezoska et al, 2012 (Anders & Huber 2010;Dillies et al, 2012). O programa utiliza um modelo de distribuição binomial e regressão local para estimar a relação entre a média e a variância das contagens obtidas para cada sequencia/gene nas diferentes amostras e estima a significância do fold-change entre elas.…”

“…O programa utiliza um modelo de distribuição binomial e regressão local para estimar a relação entre a média e a variância das contagens obtidas para cada sequencia/gene nas diferentes amostras e estima a significância do fold-change entre elas. O programa também aplica o teste de correção múltiplo de Benjamini-Hochberg aos p-valores calculados (Anders & Huber 2010;Dillies et al, 2012;Strezoska et al, 2012).…”