Maßgeschneiderte SAM‐Synthetasen zur enzymatischen Herstellung von AdoMet‐Analoga mit Photoschutzgruppen und zur reversiblen DNA‐Modifizierung in Kaskadenreaktionen

Abstract

Die Methylierung und Demethylierung von DNA, RNA und Proteinen stellt einen wichtigen Regulationsmechanismus dar. Um die Funktionen dieser Modifikationen aufzuklären, wären Werkzeuge nützlich, die die sequenzspezifische Blockierung und zeitlich präzise Freisetzung der entsprechenden Stellen ermçglichen. S-Adenosyl-l-Methionin (Ado-Met)-Analoga erweisen sich in Kombination mit Methyltransferasen (MTasen) als nützlich bei der Kartierung oder Blockierung und Freisetzung von MTase-Zielsequenzen. Allerdings war ihre enzymatische Herstellung bisher auf aliphatische Gruppen am Schwefelatom beschränkt. Wir konnten eine SAM-Synthetase aus Cryptosporidium hominis (PS-ChMAT) für die effiziente Herstellung von AdoMet-Analoga mit Photoschutzgruppen entwickeln, die von keiner der bisher bekannten WT-MATs akzeptiert werden. Die Kristallstruktur von PS-ChMAT bei 1.87 zeigt, wie das Photoschutzgruppen tragende AdoMet-Analogon in der Enzymtasche vorliegt und bahnte den Weg für die Entwicklung einer thermostabilen MAT aus Methanocaldococcus jannaschii. Die PS-MATs sind mit DNA-und RNA-MTasen kompatibel und ermçglichen die sequenzspezifische Modifizierung einer Plasmid-DNA ("Schreiben") sowie die lichtgesteuerte Entfernung ("Lçschen"). Einleitung Die Methylierung von DNA, RNA und Histonen ist oft reversibel und stellt einen Regulationsmechanismus dar, der direkte Auswirkungen auf grundlegende biologische Prozesse und menschliche Krankheiten hat. [1] Diese epigenetische Markierung wird durch Methyltransferasen (MTasen) eingeführt, die typischerweise S-Adenosyl-l-Methionin (SAM oder AdoMet) als Methyldonor verwenden. [2] In der DNA führt m 5 C (5-Methylcytosin) zur Inaktivierung der Transkriptions-Start-Sequenzen, während die oxidative Entfer-nung die Genexpression wiederherstellt. Kürzlich wurde gezeigt, dass m 6 A (N 6-Methyladenosin) in der DNA an der Aktivierung und Hemmung der Transkription beteiligt ist. [2d, 3] Die Fähigkeit, solche Methyltransferase-Zielsequenzen zu blockieren und sie zu einem definierten Zeitpunkt mit einem orthogonalen Auslçser freizusetzen, würde eingehende Studien ermçglichen, die erforderlich sind, um die biologische Funktion im Detail zu verstehen. [1d] Photoschutzgruppen sind wirkungsvolle Werkzeuge zur Untersuchung biomolekularer Wechselwirkungen und Funktionen. [4] Sie wurden erfolgreich für DNA, RNA und Proteine in vitro, in Zellen und in vivo eingesetzt. [4a,b] Ihre Entfernung durch Licht rekonstituiert das native Biomolekül und lässt sich mit ausgezeichneter räumlicher und zeitlicher Präzision steuern. Die 2-Nitrobenzyl-Gruppe (ONB) und ihre Derivate sind aufgrund ihrer hohen Stabilität und leichten Darstellbarkeit weit verbreitet. [5] Wir und andere konnten kürzlich zeigen, dass benzylische [6] und Photoschutz-Gruppen (PS) von AdoMet-Analoga [5b, 7] mittels sterisch nicht eingeschränkter MTasen übertragen werden kçnnen und somit zur Blockierung der Zielsequenzen dieser Enzyme geeignet sind. Die Aktivität einer MTase zur Installation einer PS-Gruppe ("Schreiben") kann also mit Licht zur Entfernung ...

Enzymatic Generation of Double‐Modified AdoMet Analogues and Their Application in Cascade Reactions with Different Methyltransferases

“…Site‐directed mutagenesis was performed on RnCOMT cDNA by using Phusion high‐fidelity DNA polymerase (Thermo Fisher Scientific). pET28a‐PC‐MjMAT [2a,d] and pProEx‐MTAN [39] expression vectors were previously reported. pET28a‐GlaTgs‐var was prepared by subcloning of the cDNA from pRSET backbone used previously [40] …”

“…Recombinant protein expression and purification : Recombinant expression and purification conditions for PC‐MjMAT, [2a] RnCOMT‐var, [14] GlaTgs2‐var, [40] and MTAN were previously described. NovO expression and purification conditions were adapted from Pacholec et al [13] .…”

“…Synthesis of the methionine analogues : The ortho ‐nitrobenzyl‐ dl ‐homocysteine [2a] (ONB‐Hcy ; y ‐Hcy) and propargyl‐ l ‐selenohomocysteine [12] (propargyl‐ l ‐SeHcy ; z ‐SeHcy) were synthesized as previously reported.…”