Selective alkylation of pyrazoles could solve achallenge in chemistry and streamline synthesis of important molecules.Here we report catalyst-controlled pyrazole alkylation by acyclic two-enzyme cascade.Inthis enzymatic system, ap romiscuous enzyme uses haloalkanes as precursors to generate non-natural analogs of the common cosubstrate Sadenosyl-l-methionine.Asecond engineered enzyme transfers the alkylgroup in highly selective CÀNbond formations to the pyrazole substrate.The cosubstrate is recycled and only used in catalytic amounts.K ey is ac omputational enzyme-library design tool that converted ap romiscuous methyltransferase into as mall enzyme family of pyrazole-alkylating enzymes in one round of mutagenesis and screening.W ith this enzymatic system, pyrazole alkylation (methylation, ethylation, propylation) was achieved with unprecedented regioselectivity (> 99 %), regiodivergence,a nd in af irst example on preparative scale.
Die selektive Alkylierung von Pyrazolen ist eine Herausforderung in der Chemie und kçnnte die Synthese wichtiger Moleküle vereinfachen. In dieser Arbeit berichten wir über eine katalysatorgesteuerte Alkylierung von Pyrazolen durch eine cyclische Kaskadenreaktion mit zwei Enzymen. In diesem enzymatischen System nutzt ein promiskuitives Enzym Halogenalkane als Ausgangsstoffe,u mn icht-natürliche Analoga des Cosubstrats S-Adenosyl-l-Methionin zu synthetisieren. Ein zweites engineertes Enzym überträgt die Alkylgruppen in einer hochselektiven CÀN-Bindungsknüpfung auf das Pyrazol-Substrat. Das Cosubstrat wird regeneriert und nur in katalytischen Mengen eingesetzt. Fürdas Enzym-Engineering wurde eine computerbasierte Methode verwendet, um eine Mutantenbibliothek in silico zu entwickeln. In einer Runde von Mutagenese und Screening wurde somit eine promiskuitive Methyltransferase in eine kleine Pyrazol-alkylierende Enzymfamilie umgewandelt. Mit diesem bienzymatischen System konnte die Alkylierung von Pyrazolen (Methylierung, Ethylierung,P ropylierung) mit bislang unerreichter Regioselektivität(> 99 %), Regiodivergenz und in einem ersten Beispiel in präparativem Maßstab gezeigt werden. Einleitung Die regioselektive Alkylierung und Funktionalisierung von Molekülen mit mehreren, ähnlichen Heteroatomen stellt eine besondere Herausforderung in der Synthese dar. [1] Dies gilt insbesondere für N-heterozyklische Verbindungen wie Pyrazole,T riazole oder Pyridone,b ei denen die Tautomerie zu Heteroatomen mit vergleichbarer Reaktivitätf ührt. Die Alkylierung solcher N-heterozyklischen Verbindungen verläuft gewçhnlich unter Substratkontrolle und führt zu Produktmischungen, die oft nur schwer zu trennen sind (Abbildung 1A und Abbildung S1). [2] Die selektive Alkylierung erfordert den Einsatz von Schutzgruppen [3] und eine allgemeine katalysatorgesteuerte Alkylierung existiert bisher nicht. [4, 5] Angesichts der signifikanten Anzahl von CÀN-Alkylierungen, die in der medizinischen Chemie durchgeführt werden [6, 7] und basierend auf der Bedeutung solcher N-alkylierten Heterozyklen in biologisch aktiven Wirkstoffen (Abbil-Abbildung 1. (A)Pyrazolstrukturen kçnnen durch zwei verschiedene tautomere Strukturen beschriebenwerden. Die Tautomerie führt zu N-Atomen mit sehr ähnlicher Reaktivitätund sind somit in chemischen Reaktionen nur schwer zu unterscheiden. (B)S AM-abhängige Methyltransferasen kçnnen Methylgruppen mit sehr hoher Selektivitätauf komplexe Substrate übertragen. In dieser Reaktion dient S-Adenosyl-l-Methionin (SAM) als Cosubstrat und Methyldonor.A ls Nebenprodukt entsteht S-Adenosyl-l-Homocystein(SAH), das von Halogenid-Methyltransferasen unter der Verwendung von Iodmethan als Methylquellez u SAM regeneriert werden kann. [12] (C)Der hier gezeigte Ansatz nutzt promiskuitive Halogenid-Methyltransferasen zur Bildung und Regeneration von nicht-natürlichen SAM-Analoga (NSA) aus einfachen Halogenalkanen.I nKombination mit engineerten Alkyltransferasen wird eine hochselektive Pyrazol-Alkylierung ermçglicht.
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