LC-MS/MS Analysis of Surface Layer Proteins as a Useful Method for the Identification of Lactobacilli from the Lactobacillus acidophilus Group

Podleśny, Marcin; Jarocki, Piotr; Komon, Elwira; Glibowska, Agnieszka; Targoński, Zdzisław

doi:10.4014/jmb.1009.09036

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“…Nevertheless, due to the genetic similarity of the three species, in many cases inconclusive results have been obtained in the form of a mixture of numerous non-specific products and specific products of low intensity, which may contribute to misidentification. To avoid incorrect identification, experimental systems based on a sequence of differentiated genes, such as dnaK and tuf, may be used [23][24][25]. Methods such as RFLP-PCR, Multiplex PCR or HRM-PCR, which are predominantly based on the simultaneous identification of species in one reaction, also seem to be good alternatives.…”

Section: Genus Species and Subspecies-specific Pcrmentioning

confidence: 99%

Molecular Routes to Specific Identification of the Lactobacillus Casei Group at the Species, Subspecies and Strain Level

Jarocki

Komoń-Janczara

Glibowska

et al. 2020

IJMS

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The genus Lactobacillus includes, among others, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei and Lactobacillus rhamnosus, species that are collectively referred to as the Lactobacillus casei group. Many studies have shown that strains belonging to this group may decrease lactose intolerance, the effects of inflammatory bowel disease, diarrhea, constipation, food allergies and even colon cancer. Moreover, evidences exists of positive effects of these bacteria on mucosal immunity and blood cholesterol level. Because of their beneficial influence on human health, many of them are used as food additives and probiotic pharmaceuticals. It should be stressed that health-promoting properties are not attributed at the species level, but to specific strains. Therefore, procedures are necessary to allow specific identification at each phylogenetic level—genus, species and strain. In this paper we present a practical overview of molecular methods for the identification and differentiation of L. casei bacteria. The research included 30 bacterial strains belonging to three species: L.casei, L. paracasei and L. rhamnosus. Among the tested procedures were genus- and species-specific PCR, multiplex-PCR, Real-Time HRM analysis, RFLP-PCR, rep-PCR, RAPD-PCR, AFLP-PCR, and proteomic methods such as MALDI-TOF MS typing and SDS-PAGE fingerprinting. The obtained results showed that multiplex-PCR and MALDI-TOF MS turned out to be the most useful methods to identify the tested bacteria at the species level. At the strain level, the AFLP-PCR method showed the highest discriminatory power. We hope that the presented results will allow for the easy selection of an appropriate procedure, depending on the experiment conducted and the equipment capabilities of any given laboratory.

show abstract

Section: Genus Species and Subspecies-specific Pcrmentioning

confidence: 99%

Molecular Routes to Specific Identification of the Lactobacillus Casei Group at the Species, Subspecies and Strain Level

Jarocki

Komoń-Janczara

Glibowska

et al. 2020

IJMS

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“…genes pheS e o groEL tiveram um poder discriminatório maior, possibilitando identificar um número maior de isolados ao nível de espécie. Esses resultados corraboram com os resultados de outros trabalhos (NASER et al, 2005;NASER et al, 2007;BRUYNE et al, 2008;MADOROBA et al, 2011;OKI et al, 2011;NGUYEN et al, 2013;e PODLESNY et al, 2011)…”

Section: Teste Preliminar De Identificação De Leveduras a Partir De Uunclassified

“…Os resultados mostraram que a técnica de fingerprinting por MALDI-TOF MS foi complementar aos resultados obtidos pelo sequenciamento da região 16S rDNA, sendo uma técnica com maior poder discriminatório na identificação de espécies de Bacillus, especificamente na diferenciação entre Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens e Bacillus methylotrophicus, e também em algumas espécies do gênero de Lactobacillus. Para a discriminação de isolados de Lactobacillus, especificamente, grande parte dos trabalhos não obtiveram resultados satisfatórios quando utilizaram apenas a região 16S rDNA ( NASER et al, 2007;PODLESNY et al, 2011;DUSKOVÁ et al, 2012;DELAVENNE et al, 2013), mas quando utilizaram a técnica MLST (Multilocus Sequence Typing), sequenciando diferentes genes housekeeping como pheS, rpoA e groEL, conseguiram discriminar de maneira eficiente a maior parte dos isolados ao nível de espécie. Delavenne et al (2013), objetivando a identificação de potenciais isolados de Lactobacillus como culturas bioprotetoras no yogurte, comparou os resultados obtidos pelo sequenciamento dos genes pheS e rpoA com análises de fingerprinting utilizando MALDI-TOF MS e obteve resultados similares e satisfatórios com alta capacidade de discriminação de todos os isolados testados.…”

Section: Introductionunclassified

“…2,5 mM); 0,3 μL de Taq Polimerase (1un/ reação); 1 μL de cada oligonucleotídeo iniciador (10 mM), 1 μL de DNA alvo e 15,45 μL de água ultrapura estéril, totalizando o volume final da reação de 25 μL.O modelo utilizado para a amplificação em termociclador do genes phES (primers 21F/23R) foi baseado em Naser e colaboradores (2005 ª) com adaptações: desnaturação inicial do DNA a 95 • C por 10 minutos; 8 ciclos ( 1 foi por luz U.V. Os tamanhos do fragmento esperado dos dois genes housekeeping é de aproximadamente 500 pb(NASER et al, 2005ª;PODLESNY et al,2011). Sequência dos primers utilizados para amplificação dos três genes housekeeping selecionados, com suas respectivas temperaturas de anelamento, posições e referência na literatura.…”

unclassified

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Desenvolvimento de um método rápido de identificação, ao nível de espécie, de >i<Lactobacillus>/i< e >i<Saccharomyces>/i< em dornas de fermentação, por meio da técnica de MALDI-TOF MS: validação molecular e construção do banco de dados espectral

Fonseca¹

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Bactérias ácido láticas 2. Fermentação 3. Espectrometria de massas 4. Fingerprinting I.Título AGRADECIMENTOS Eu queria demonstrar minha completa gratidão a todos que me ajudaram de alguma forma na realização deste trabalho. Agradeço, primeiramente, ao Prof. Labate, pela orientação, aprendizado, incentivo e carinho nesses muitos anos de convívio, por ter enxergado potencial em mim desde que eu era uma aluna de mestrado. Agradeço à Mônica pelo constante suporte tanto profissional quanto pessoal, pelos seus dotes culinários, humildade e delicadeza. Pelas piadas, risadas, carinho, mas, principalmente, agradeço por sua generosidade em ensinar. Biologia molecular virou uma paixão também para mim. Gostaria de agradecer especialmente a Thais, especialista do laboratório, por todo ensinamento em espectrometria de massas dado com muita paciência, por ter me incentivado quando achei que não era capaz, me apoiado e contribuído substancialmente para meu amadurecimento como pessoa e, principalmente como pesquisadora. Esse trabalho é nosso! Eu queria agradecer a todos os integrantes da turminha Max Feffer:

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“…1.1, espectros E-S). El uso de los datos obtenidos por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas para las proteínas de capa S ha sido propuesto previamente para tipificar cepas del grupo L. acidophilus(Podlesny et al 2011). En nuestro caso, se ha utilizado para distinguir cepas dentro de la misma especie.SLP CIDCA 8310, 8314, 8315, 8317, 8332, 8335, 8343, 8381, 8385, 83111, 83113*, 83116, ATCC 8007 and JCM 5818*) de L. kefiri.…”

unclassified

Proteínas superficiales de bacterias lácticas con potencialidad biotecnológica: estudios estructurales y funcionales de las proteínas de capa S de Lactobacillus kefiri

Malamud¹

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La capa S es una estructura de envoltura glico-proteica constituida por subunidades que se auto-ensamblan para formar una matriz bidimensional que cubre completamente la superficie de diferentes especies de bacterias y Arqueas. Debido a su capacidad de formar productos auto-ensamblados en solución, son herramientas atractivas para ser utilizadas como carriers de antígenos o como adyuvantes. Teniendo en cuenta las características funcionales y estructurales extraordinarias que poseen las proteínas de capa S, el objetivo general de este trabajo de tesis fue realizar una caracterización estructural y funcional de las proteínas de capa S de diferentes cepas de Lactobacillus kefiri con el objetivo de desarrollar nuevas herramientas biotecnológicas. En cuanto a la caracterización de la estructura primaria, utilizando técnicas proteómicas y genómicas fuimos capaces de determinar las secuencias de aminoácidos de las proteínas de capa S en dieciséis cepas de L. kefiri, y las secuencias de nucleótidos de los genes que codifican para estas proteínas. Teniendo en cuenta la naturaleza glicoproteica de las proteínas de capa S de L. kefiri, seleccionamos 4 proteínas de capa S provenientes de diferentes cepas de L. kefiri y analizamos la estructura de glicanos unidos a estas proteínas. En las cepas L. kefiri CIDCA 8321 y CIDCA 8348, se encontraron O-glicanos en el mismo motivo de glicosilación descripto para L. buchneri, sustituido por hasta 22 unidades de glucosa. La cepa L. kefiri CIDCA 83111 presenta el mismo glicopéptido, pero sustituido en 4 residuos de serina con un promedio de ocho unidades de glucosa, decoradas con ácido galacturónico. Además, la SLP-83111 cuenta con otro péptido O-glicosilado, con una estructura Glc5-8GalA2, y dos péptidos N-sustituidos con estructuras cortas: GlcNAc4Man3dHex y GlcNAc2dHex. La cepa L. kefiri JCM 5818 cuenta con un O-glicano en la misma posición mencionada para las otras tres cepas, sustituido en promedio con ocho unidades de glucosa, y un N-glicano de estructura compleja con ácido siálico en su estructura. Por último, analizamos las propiedades inmunoestimulatorias de las glicoproteínas de capa S de L. kefiri (SLPs) y el rol funcional que tienen los glicanos sobre estas propiedades. Utilizando líneas celulares de macrófagos demostramos que las proteínas de capa S de las cepas L. kefiri CIDCA 8321, L. kefiri CIDCA 8348, L. kefiri CIDCA 83111 y L. kefiri JCM 5818, si bien no son capaces de inducir una activación de los macrófagos, potencian la respuesta a un agonista TLR, en un proceso dependiente de la presencia de Ca+2 y de la actividad biológica de los glicanos presentes en las glicoproteínas de capa S. Utilizando BMDCs derivadas de ratones deficientes de CLRs específicos, pudimos identificar que la SLP-8321 y SLP-8348 son reconocidas y señalizan a través de Mincle, mientras que la SLP-5818 lo hace a través de SignR3. Esta interacción entre las SLPs y BMDCs induce una activación celular que resulta en un aumento en la capacidad estimulatoria de células T en ensayos de proliferación antígeno-específico. Finalmente, demostramos que la SLP-8348 posee capacidad adyuvante utilizando OVA como antígeno modelo, y que este efecto depende de la actividad biológica de los glicanos presentes en esta glicoproteína de capa S.

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LC-MS/MS Analysis of Surface Layer Proteins as a Useful Method for the Identification of Lactobacilli from the Lactobacillus acidophilus Group

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Molecular Routes to Specific Identification of the Lactobacillus Casei Group at the Species, Subspecies and Strain Level

Molecular Routes to Specific Identification of the Lactobacillus Casei Group at the Species, Subspecies and Strain Level

Desenvolvimento de um método rápido de identificação, ao nível de espécie, de >i<Lactobacillus>/i< e >i<Saccharomyces>/i< em dornas de fermentação, por meio da técnica de MALDI-TOF MS: validação molecular e construção do banco de dados espectral

Proteínas superficiales de bacterias lácticas con potencialidad biotecnológica: estudios estructurales y funcionales de las proteínas de capa S de Lactobacillus kefiri

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