Identification of microorganisms by PCR amplification and sequencing of a universal amplified ribosomal region present in both prokaryotes and eukaryotes

Rivas, Raúl; Velázquez, Encarna; Zurdo-Piñeiro, José Luis; Mateos, Pedro F.; Molina, E.

doi:10.1016/j.mimet.2003.11.007

Cited by 41 publications

(27 citation statements)

References 49 publications

Supporting

Mentioning

Contrasting

Unclassified

Order By: Relevance

“…Detection of chloroplasts was expected because plant materials, such as hot pepper or garlic, are used as ingredients in the fermented seafood products and the chloroplasts contain 16S rRNA genes. Coamplification of non-target eukaryotic 18S rDNA by commonly used universal 16S rDNA-targeting PCR primers has been reported and is probably because of the low specificity of the primer sets used in earlier studies (Ampe et al, 1999;Ampe and Miambi, 2000;Huys et al, 2008;Rivas et al, 2004).…”

Section: Resultsmentioning

confidence: 99%

Investigation of archaeal and bacterial diversity in fermented seafood using barcoded pyrosequencing

et al. 2009

View full text Add to dashboard Cite

Little is known about the archaeal diversity of fermented seafood; most of the earlier studies of fermented food have focused on lactic acid bacteria (LAB) in the fermentation process. In this study, the archaeal and bacterial diversity in seven kinds of fermented seafood were culture-independently examined using barcoded pyrosequencing and PCR-denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) methods. The multiplex barcoded pyrosequencing was performed in a single run, with multiple samples tagged uniquely by multiplex identifiers, using different primers for Archaea or Bacteria. Because PCR-DGGE analysis is a conventional molecular ecological approach, this analysis was also performed on the same samples and the results were compared with the results of the barcoded pyrosequencing analysis. A total of 13 372 sequences were retrieved from 15 898 pyrosequencing reads and were analyzed to evaluate the diversity of the archaeal and bacterial populations in seafood. The most predominant types of archaea and bacteria identified in the samples included extremely halophilic archaea related to the family Halobacteriaceae; various uncultured mesophilic Crenarchaeota, including Crenarchaeota Group I.1 (CG I.1a and CG I.1b), Marine Benthic Group B (MBG-B), and Miscellaneous Crenarchaeotic Group (MCG); and LAB affiliated with genus Lactobacillus and Weissella. Interestingly, numerous uncultured mesophilic Crenarchaeota groups were as ubiquitous in the fermented seafood as in terrestrial and aquatic niches; the existence of these Crenarchaeota groups has not been reported in any fermented food. These results indicate that the archaeal populations in the fermented seafood analyzed are diverse and include the halophilic and mesophilic groups, and that barcoded pyrosequencing is a promising and cost-effective method for analyzing microbial diversity compared with conventional approaches.

show abstract

Section: Resultsmentioning

confidence: 99%

Investigation of archaeal and bacterial diversity in fermented seafood using barcoded pyrosequencing

et al. 2009

View full text Add to dashboard Cite

show abstract

“…Với ưu ñiểm nhanh chóng, chính xác với ñộ tin cậy rất cao và yêu cầu lượng ADN ban ñầu rất thấp, kỹ thuật PCR ñược nhanh chóng áp dụng rộng rãi ñể chẩn ñoán các bệnh về virus, vi khuẩn, các bệnh ký sinh trùng và cho kết quả rất chính xác. Bên cạnh ñó, với ñặc tính sao chép chính xác thành phần và trật tự nucleotide trong chuỗi ADN, PCR còn có vai trò quan trọng trong việc phân tích trình tự và cấu trúc ADN, có ý nghĩa to lớn trong phân loại các loài vi sinh vật [16,20].…”

Section: Mở đầUunclassified

A simple protocol for the production of commercial-grade Taq DNA polymerase and its “hot start” version at laboratory scale

Nam¹,

Chong²,

Dung³

2015

V J Bio

View full text Add to dashboard Cite

TÓM TẮT: Phản ứng nối kết chuỗi các phân tử nucleotide hay còn gọi là PCR (Polymerase Chain Reaction) sử dụng enzyme ADN polymerase và các thành phần khác ñể khuếch ñại ñoạn ADN mục tiêu, trong ñó enzyme ADN polymerase ñóng vai trò then chốt. Vector mang gen mã hóa cho ADN polymerase từ vi khuẩn ưa nhiệt Thermus aquaticus ñược biến nạp vào tế bào Escherichia coli ñể biểu hiện enzyme này. Taq ADN polymerase tái tổ hợp ñược tinh sạch theo quy trình ñơn giản, dễ thực hiện gồm các bước phá tế bào bằng sóng siêu âm, ly tâm lấy dịch chiết, xử lý nhiệt, kết tủa bằng ammonium sulphate và thẩm tích qua ñêm. Enzyme thu ñược có ñộ sạch cao khi kiểm tra bằng ñiện di protein và có họat tính tương ñương với enzyme thương mại khi so sánh bằng phản ứng khuyếch ñại ADN. Cứ mỗi 500 mL môi trường kết hợp nuôi cấy lắc chúng tôi thu ñược 2,0-2,5 ml enzyme có họat tính tương ñương với 7.000-8.000 ñơn vị Taq ADN polymerase thương mại có giá trị tương ñương với sản phẩm nhập khẩu khoảng 30 triệu ñồng. Thử nghiệm tạo chế phẩm "hotstart" enzyme chúng tôi thấy tỉ lệ pha trộn 100 : 1 (nanogram kháng thể : ñơn vị Taq) có khả năng ngăn chặn sự hình thành các băng ADN không ñặc hiệu. Enzyme thu ñược cho thấy có thể thích ứng với phản ứng PCR có ADN khuôn có ñộ phức tạp khác nhau như ADN genome, ADN plasmid hay ADN bổ sung (cDNA). Quy trình này có thể nhân rộng ñể tự sản xuất Taq ADN polymerase sử dụng trong phòng thí nghiệm.Từ khóa: enzyme tái tổ hợp, hotstart Taq ADN polymerase, Taq ADN polymerase, protein tái tổ hợp. MỞ ĐẦUPCR (còn gọi là phản ứng nối kết chuỗi các phân tử nucleotide) là phương pháp khuếch ñại ñoạn gen mong muốn dưới tác dụng của enzyme ADN polymerase ñể tạo ra hàng ngàn ñến hàng triệu bản sao ADN. PCR ñược Mulis et al. (1985) [14] phát minh, ñưa lại một cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử, giúp phân tích từng gen mục tiêu nhỏ lẻ trong một hệ gen có cấu trúc phức tạp khổng lồ. Với ưu ñiểm nhanh chóng, chính xác với ñộ tin cậy rất cao và yêu cầu lượng ADN ban ñầu rất thấp, kỹ thuật PCR ñược nhanh chóng áp dụng rộng rãi ñể chẩn ñoán các bệnh về virus, vi khuẩn, các bệnh ký sinh trùng và cho kết quả rất chính xác. Bên cạnh ñó, với ñặc tính sao chép chính xác thành phần và trật tự nucleotide trong chuỗi ADN, PCR còn có vai trò quan trọng trong việc phân tích trình tự và cấu trúc ADN, có ý nghĩa to lớn trong phân loại các loài vi sinh vật [16,20].Tuy nhiên thách thức lớn của phương pháp PCR là yêu cầu enzyme xúc tác có hoạt tính bền trong ñiều kiện nhiệt ñộ cao. Taq ADN polymerase là enzyme bền nhiệt ñáp ứng ñược các yêu cầu này [5]. Taq polymerase, còn gọi là Taq pol hoặc Taq, là enzyme ADN polymerase chịu nhiệt, có nguồn gốc từ vi khuẩn ưa nhiệt Thermus aquaticus ñược phát hiện lần ñầu tiên năm 1965, có hoạt tính polymerase cao và khả năng chịu nhiệt tốt, phù hợp với ñiều kiện hoạt ñộng của phản ứng PCR [2,18]. Taq ADN polymerase xúc tác cho sự kết hợp của dNTP vào ADN với tỷ lệ khoảng một ngàn cặp nucleotide mỗi phút trong môi trường ñệm phù hợp chứa ADN khuôn và ion Mg 2+ ñóng vai trò cofactor. Taq ADN polymerase có...

show abstract

“…A selection of broad-range primers for the 16S and 23S rRNA genes is provided in Table 1. Further primer and probe sequences for 16S and 23S rRNA gene can be found in other articles (1,4,6,9,61,63,76,88,123,133,150,155), as well as in the European rRNA database (http: / / bioinformatics.psb.ugent.be / webtools / rRNA) (166) and in the ProbeBase database (http://www.microbial-ecology. net / probebase) (84).…”

Section: Primer Systems For Broad-range Pcrmentioning

confidence: 99%

Broad‐Range PCR for Detection and Identification of Bacteria

Maiwald¹

2011

Molecular Microbiology

View full text Add to dashboard Cite

Identification of microorganisms by PCR amplification and sequencing of a universal amplified ribosomal region present in both prokaryotes and eukaryotes

Cited by 41 publications

References 49 publications

Investigation of archaeal and bacterial diversity in fermented seafood using barcoded pyrosequencing

Investigation of archaeal and bacterial diversity in fermented seafood using barcoded pyrosequencing

A simple protocol for the production of commercial-grade Taq DNA polymerase and its “hot start” version at laboratory scale

Broad‐Range PCR for Detection and Identification of Bacteria

Contact Info

Product

Resources

About