A simple protocol for the production of commercial-grade Taq DNA polymerase and its “hot start” version at laboratory scale

Abstract

TÓM TẮT: Phản ứng nối kết chuỗi các phân tử nucleotide hay còn gọi là PCR (Polymerase Chain Reaction) sử dụng enzyme ADN polymerase và các thành phần khác ñể khuếch ñại ñoạn ADN mục tiêu, trong ñó enzyme ADN polymerase ñóng vai trò then chốt. Vector mang gen mã hóa cho ADN polymerase từ vi khuẩn ưa nhiệt Thermus aquaticus ñược biến nạp vào tế bào Escherichia coli ñể biểu hiện enzyme này. Taq ADN polymerase tái tổ hợp ñược tinh sạch theo quy trình ñơn giản, dễ thực hiện gồm các bước phá tế bào bằng sóng siêu âm, ly tâm lấy dịch chiết, xử lý nhiệt, kết tủa bằng ammonium sulphate và thẩm tích qua ñêm. Enzyme thu ñược có ñộ sạch cao khi kiểm tra bằng ñiện di protein và có họat tính tương ñương với enzyme thương mại khi so sánh bằng phản ứng khuyếch ñại ADN. Cứ mỗi 500 mL môi trường kết hợp nuôi cấy lắc chúng tôi thu ñược 2,0-2,5 ml enzyme có họat tính tương ñương với 7.000-8.000 ñơn vị Taq ADN polymerase thương mại có giá trị tương ñương với sản phẩm nhập khẩu khoảng 30 triệu ñồng. Thử nghiệm tạo chế phẩm "hotstart" enzyme chúng tôi thấy tỉ lệ pha trộn 100 : 1 (nanogram kháng thể : ñơn vị Taq) có khả năng ngăn chặn sự hình thành các băng ADN không ñặc hiệu. Enzyme thu ñược cho thấy có thể thích ứng với phản ứng PCR có ADN khuôn có ñộ phức tạp khác nhau như ADN genome, ADN plasmid hay ADN bổ sung (cDNA). Quy trình này có thể nhân rộng ñể tự sản xuất Taq ADN polymerase sử dụng trong phòng thí nghiệm.Từ khóa: enzyme tái tổ hợp, hotstart Taq ADN polymerase, Taq ADN polymerase, protein tái tổ hợp. MỞ ĐẦUPCR (còn gọi là phản ứng nối kết chuỗi các phân tử nucleotide) là phương pháp khuếch ñại ñoạn gen mong muốn dưới tác dụng của enzyme ADN polymerase ñể tạo ra hàng ngàn ñến hàng triệu bản sao ADN. PCR ñược Mulis et al. (1985) [14] phát minh, ñưa lại một cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử, giúp phân tích từng gen mục tiêu nhỏ lẻ trong một hệ gen có cấu trúc phức tạp khổng lồ. Với ưu ñiểm nhanh chóng, chính xác với ñộ tin cậy rất cao và yêu cầu lượng ADN ban ñầu rất thấp, kỹ thuật PCR ñược nhanh chóng áp dụng rộng rãi ñể chẩn ñoán các bệnh về virus, vi khuẩn, các bệnh ký sinh trùng và cho kết quả rất chính xác. Bên cạnh ñó, với ñặc tính sao chép chính xác thành phần và trật tự nucleotide trong chuỗi ADN, PCR còn có vai trò quan trọng trong việc phân tích trình tự và cấu trúc ADN, có ý nghĩa to lớn trong phân loại các loài vi sinh vật [16,20].Tuy nhiên thách thức lớn của phương pháp PCR là yêu cầu enzyme xúc tác có hoạt tính bền trong ñiều kiện nhiệt ñộ cao. Taq ADN polymerase là enzyme bền nhiệt ñáp ứng ñược các yêu cầu này [5]. Taq polymerase, còn gọi là Taq pol hoặc Taq, là enzyme ADN polymerase chịu nhiệt, có nguồn gốc từ vi khuẩn ưa nhiệt Thermus aquaticus ñược phát hiện lần ñầu tiên năm 1965, có hoạt tính polymerase cao và khả năng chịu nhiệt tốt, phù hợp với ñiều kiện hoạt ñộng của phản ứng PCR [2,18]. Taq ADN polymerase xúc tác cho sự kết hợp của dNTP vào ADN với tỷ lệ khoảng một ngàn cặp nucleotide mỗi phút trong môi trường ñệm phù hợp chứa ADN khuôn và ion Mg 2+ ñóng vai trò cofactor. Taq ADN polymerase có...