Hydrolysis and amino acid composition analysis of proteins

Fountoulakis, Michael; Lahm, Hans‐Werner

doi:10.1016/s0021-9673(98)00721-3

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“…The concentration of each compound was determined by quantitative amino acid composition analysis using ortho-phtalaldehyde (OPA) as a derivatization agent following acid hydrolysis (28). Concentrations were calculated based on the total amount of cystine in each sample.…”

Section: Methodsmentioning

confidence: 99%

Quantifying Escherichia coli Glutaredoxin-3 Substrate Specificity Using Ligand-induced Stability

Elgán

Berndt

2008

Journal of Biological Chemistry

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Traditionally, quantification of protein-ligand affinity is performed using kinetic or equilibrium measurements. However, if the binding reaction proceeds via a stable covalent complex, these approaches are often limited. By exploiting the fact that the conformational stabilization of a protein is altered upon ligand binding due to specific interactions, and using an array of selectively chosen ligand analogs, one can quantify the contribution individual interactions have on specificity. We have used ligand-induced stability as a basis to dissect the interaction between glutaredoxin-3 (Grx3) and one of its native substrates, the tripeptide glutathione. Taking advantage of the fact that Grx3 can be trapped in a covalent mixed disulfide to glutathione or to selected synthetic glutathione analogs as part of the natural catalytic cycle, individual contributions to binding of specific molecular groups can be quantified by changes in ligand-induced stability. These changes in conformational stability are interpreted in terms of interaction energies (i.e. specificity) of the particular groups present on the ligand analog. Our results illustrate that although Grx3 recognizes glutathione predominantly through independent and additive ionic interactions at the N-and C-terminal of glutathione, van der Waals interactions from the unique ␥-glutamate moiety of glutathione also play an important role. This study places us closer to understanding the complex task of accommodating multiple substrate specificities in proteins of the thioredoxin superfamily and underscores the general applicability of ligand-induced stability to probe substrate specificity.In the era of structural genomics, a large number of biomolecules will have their tertiary structure determined. However, to fully appreciate the potential of these structures, it is fundamental to determine how these molecules interact with other molecules. Therefore, when exploring the structural basis of observed biological activity it is of great importance to investigate the details of intermolecular interactions. One way of attaining a deeper insight into these interactions is by quantifying ligand affinity, usually performed by kinetic or equilibrium measurements of the binding reaction. Specific interactions between a ligand and a protein can be investigated further by modifying specific residues within the protein using site-directed mutagenesis. The relative binding constants of a wildtype and a mutant protein to a particular ligand then provide information about specificity. However, protein mutagenesis sometimes results in secondary effects as intrinsic properties of the protein may be altered, making subsequent analysis complex. Furthermore, if the interaction between two molecules involves a relatively stable covalent intermediate, standard methods of measuring affinity are often of limited value.Several studies have demonstrated that the free energy of non-covalent binding of a ligand to a protein results in a change in conformational stabilization with respect to...

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Section: Methodsmentioning

confidence: 99%

Quantifying Escherichia coli Glutaredoxin-3 Substrate Specificity Using Ligand-induced Stability

Elgán

Berndt

2008

Journal of Biological Chemistry

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“…Different conditions of hydrolysis would make inter-laboratory comparisons of k Asp and (D/L) 0 difficult. The hydrolysis process for amino acid analysis induces racemization of amino acids, and the degree of racemization is affected by experimental conditions such as processing time, temperature, phase of acid, and additive agent [22]. Therefore, the degree of racemization must be determined by each laboratory in order to allow (D/L) act and the earplug ages in the 17 whales (Fig.…”

Section: Effect Of Hydrolysismentioning

confidence: 99%

“…A decrease in the degree of racemization through the hydrolysis process contributes to improve the accuracy and precision of AAR age. This study adopted gas-phase hydrolysis, because the degree of racemization in gas-phase hydrolysis was lower than that in the liquid-phase [22] which is the common method for whale age estimation using AAR.…”

Section: Standard Error Of Age Estimated By Aarmentioning

confidence: 99%

Age estimation of Antarctic minke whales Balaenoptera bonaerensis based on aspartic acid racemization technique

Yasunaga¹,

Pastene²,

Bando³

et al. 2017

Fish Sci

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“…Um parâmetro limitante que permanece no desenvolvimento da análise de aminoácidos é a confiança na preparação dos hidrolisados protéicos para o método cromatográfico, principalmente quanto à eliminação dos reagentes da hidrólise [11,12,32]. A neutralização ou evaporação dos agentes hidrolíticos é importante fator de discussão.…”

Section: -Introduçãounclassified

“…Entretanto, muitos problemas ainda persistem, relacionados principalmente à hidrólise, ao preparo dos hidrolisados e à constituição da amostra. O método tradicional de hidrólise, com o uso de ácido clorídrico 6 N a 110°C, é reconhecido como padrão e o mais utilizado, apesar de promover a destruição parcial ou total dos aminoácidos, especialmente cistina, metionina e triptofano.Um parâmetro limitante que permanece no desenvolvimento da análise de aminoácidos é a confiança na preparação dos hidrolisados protéicos para o método cromatográfico, principalmente quanto à eliminação dos reagentes da hidrólise [11,12,32]. A neutralização ou evaporação dos agentes hidrolíticos é importante fator de discussão.…”

unclassified

Preparo de hidrolisados protéicos para a análise de aminoácidos

Bernardi¹,

Luiz²,

Zanotto³

et al. 2003

Ciênc. Tecnol. Aliment.

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Na análise de aminoácidos, avanços importantes foram obtidos quanto aos equipamentos e reagentes. Entretanto, muitos problemas ainda persistem, relacionados principalmente à hidrólise, ao preparo dos hidrolisados e à constituição da amostra. O método tradicional de hidrólise, com o uso de ácido clorídrico 6 N a 110°C, é reconhecido como padrão e o mais utilizado, apesar de promover a destruição parcial ou total dos aminoácidos, especialmente cistina, metionina e triptofano.Um parâmetro limitante que permanece no desenvolvimento da análise de aminoácidos é a confiança na preparação dos hidrolisados protéicos para o método cromatográfico, principalmente quanto à eliminação dos reagentes da hidrólise [11,12,32]. A neutralização ou evaporação dos agentes hidrolíticos é importante fator de discussão. O alto teor de sal resultante da neutralização, levado para a coluna de troca iônica, produz alargamento dos picos e não pode ser aplicado a todas as resinas, enquanto que a evaporação até a secagem pode acarretar perdas na recuperação dos aminoá-cidos durante esse procedimento [4,15,30].O método mais comumente empregado para a eliminação dos reagentes da hidrólise é o da utilização de evaporadores rotativos sob vácuo [5,7,14,17,20,22,24,30]. Entretanto, para grandes quantidades de amostras torna-se um ponto crítico, pela morosidade e necessidade de acompanhamento contínuo, transformandose em condição de estrangulamento e demora na análi-se. Para diminuir o tempo na evaporação de amostras foram propostos procedimentos utilizando sistemas de evaporação para várias amostras simultâneas [1,12,20,21].Um tratamento alternativo, utilizado em muitos laboratórios, baseia-se na remoção dos reagentes em dessecadores ou câmaras a vácuo em presença de pastilhas de hidróxido de sódio e/ou pentóxido de fósforo [2,13,24].O objetivo deste trabalho foi comparar metodologias de preparo dos hidrolisados protéicos por neutralização ou evaporação dos reagentes da hidrólise, para posterior análise de aminoácidos em amostras contendo baixo, médio e alto teor protéico. -MATERIAL E MÉTODOSOs experimentos envolvendo os testes de metodologias quanto ao preparo das amostras, hidrólise de proteínas, separação e quantificação dos aminoácidos foram realizados no Laboratório de Análises Fisico-Quími-cas da EMBRAPA Suínos e Aves, em Concórdia SC. RESUMOAmostras de milho, farelo de soja e hidrolisado ácido de caseína foram submetidas à hidrólise ácida em estufa (110 ± 5°C, durante 22 horas) com ácido clorídrico 6 N, em ampolas de vidro seladas sob vácuo. Os hidrolisados foram preparados por quatro métodos: 1) evaporação em evaporador rotativo sob vácuo; 2) evaporação em câmaras a vácuo em presença de pastilhas de NaOH; 3) evaporação em bloco de aquecimento sob fluxo de argônio; 4) neutralização com solução padrão de citrato/NaOH. Os aminoácidos foram separados e quantificados em analisador específico Beckman System 6300 com derivatização pós-coluna por ninidrina. O método de neutralização dos reagentes da hidrólise apresentou os melhores resultados consi...

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Hydrolysis and amino acid composition analysis of proteins

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Quantifying Escherichia coli Glutaredoxin-3 Substrate Specificity Using Ligand-induced Stability

Quantifying Escherichia coli Glutaredoxin-3 Substrate Specificity Using Ligand-induced Stability

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Preparo de hidrolisados protéicos para a análise de aminoácidos

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