Minyak nilam memiliki kandungan α-guaiene sebagai salah satu komponen dominan. Senyawa α-guaiene merupakan salah satu golongan seskuiterpen yang memiliki kemampuan antibakteri, namun belum ada laporan tentang aktivitas antimikroba dari senyawa α-guaiene. Bakteri Staphylococcus aureus dan Staphylococcus epidermidis merupakan mikrobial normal manusia yang sering menyebabkan infeksi nosokomial (berasal dari lingkungan rumah sakit). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri α-guaiene kemurnian 37,50%. Metode yang digunakan adalah uji diameter daya hambat metode difusi sumuran terhadap bakteri S. aureus ATCC 25923 dan S. epidermidis ATCC 12228. Penelitian ini menggunakan variasi konsentrasi αguaiene sebesar 20%, 40%, 60%, 80%, dan 100%. Bahan α-guaiene yang digunakan, merupakan hasil dari proses destilasi fraksinasi minyak nilam, sehingga diperoleh komponen α-guaiene dengan kemurnian 37,50%. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa komponen α-guaiene kemurnian 37,50% mampu menghambat pertumbuhan kedua bakteri uji, dengan aktivitas antibakteri tertinggi terdapat pada bakteri S. aureus variasi konsentrasi 60% dengan nilai diameter hambatan rata-rata 10,33 mm. Kesimpulannya, komponen α-guaiene kemurnian 37,50% menunjukkan adanya aktivitas antibakteri.