Enrichment Cultivation of Beer-Spoiling Lactic Acid Bacteria

Abstract

Various molecular methods have been developed for the rapid microbiological analysis of beer and brewing process samples. However, enrichment cultivation is still needed in order to reach the detection limits of the molecular assays, and it may directly contribute to the costs and accuracy of detection. The selection of proper enrichment cultivation conditions may be complex due to the wide variety of available media, and controversial reports of their performance. Therefore, this article aims to clarify this process by summarizing the main factors affecting the growth of lactic acid bacteria (LAB) in the enrichment cultures and reported media for this purpose.

125th Anniversary Review: Microbiological Instability of Beer Caused by Spoilage Bacteria

“…It was thus reasonable to say that the environments provided by the detection media were drastically different from those encountered in beer brewing environments. For other microorganisms, it has been reported that the sudden changes in living environments induce a shock state, resulting in the loss of culturability on media 154 . Accordingly, it was quite conceivable that highly beer-adapted LAB strains lapse into a shock state when they suddenly encounter an unfamiliar environment such as a conventional detection medium.…”

Microbiological Diversity and Prevalence of Spoilage and Pathogenic Bacteria in Commercial Fermented Alcoholic Beverages (Beer, Fruit Wine, Refined Rice Wine, and Yakju)

“…In addition, 1 ml of FAB sample was spread plated onto five plates to reduce the detection limit to 1 CFU/ml. The selective agars and incubation conditions used for each target microorganism were as follows: plate count agar (Difco, BD, Sparks, MD) for APC (35°C, 48 h), Lactobacilli MRS agar (Difco, BD) containing 0.002% bromophenol blue for LAB (5% C 0 2, 37°C, 72 h) (23,44), GYC medium (containing 10% glucose, 1.0% yeast extract, 2.0% calcium carbonate, and 1.5% agar) (30°C, 72 h) followed by AE medium (containing 0.5% glucose, 0.3% yeast extract, 0.4% peptone. 0.9% agar, 3 ml of absolute ethanol, and 3 ml of glacial acetic acid per 1 liter) (30°C, 120 h) for AAB (16), potato dextrose agar (Difco, BD) containing 10% tartaric acid (pH 3.5) for fungi (25°C, 120 h), and violet red bile agar (Difco, BD) for colifonns (37°C, 24 h).…”

Lactic acid bacteria and cultivation methods of their detection - Part I.

“…1)� Striktně aerobní mikroorganismy vyžadují pro svůj růst kyslík -ve zkumavce s půdou rostou ve svrchní části sloupce půdy (a); fakultativně anaerobní organismy jsou schopny "nastavit" svůj metabolismus (tj� respiratorní nebo fermentativní) podle dostupnosti kyslíku -ve sloupci půdy budou převažovat spíše u hladiny, neboť respirací získají více energie než fermentací (b); striktní anaerobi vyžadují prostředí bez kyslíku (kyslík je pro ně toxický) a ve zkumavce rostou ve spodní části sloupce (c); aerotolerantní anaerobi nepotřebují kyslík, ale tolerují ho, není pro ně toxický -ve zkumavce rostou v celém objemu sloupce půdy (d); mikroaerofilní organismy mají specifické požadavky na kyslík -potřebují ho, ale pouze v určitém koncentračním rozmezí, vysoké koncentrace kyslíku jsou pro ně toxické -ve zkumavce rostou ve svrchní části sloupce, nikoliv však přímo u hladiny (e) (Hogg, 2005)� Pro kultivaci bakterií mléčného kvašení jsou doporučovány anaerobní podmínky, které lze navodit např� použitím vyvíječe anaerobní atmosféry a inkubací ve vzduchotěsných nádobách ("anaerostatech", "anaerobních hrncích"), nebo přímou inkubací v CO 2 -inkubá-toru, kde je anaerobní atmosféry dosaženo přímo plynem z tlakové lahve� Kultivační teplota v rozmezí 25-30 °C vyhovuje většině mléč-ných bakterií vyskytujících se ve vzorcích z pivovarského prostředí� V metodikách EBC je jako optimální teplota doporučována 27±1 °C, anaerobní inkubace, doba inkubace 5-7 dní� I malé snížení kultivační teploty může vést k prodloužení lag-fáze a snížení růstové rychlosti bakterií a tím k prodloužení doby inkubace potřebné k vytvoření viditelných kolonií (Taskila et al�, 2011;European Brewery Convention, 2011)� Urychlení detekce mléčných bakterií ve vzorku umožňuje technika odečítání mikrokolonií -viditelné kolonie jsou tvořeny mnoha miliony buněk a dosažení velikosti kolonie viditelné pouhým okem (tedy "standardní technika") trvá u mléčných bakterií adaptovaných na pivo několik dní� Metoda odečítání mikrokolonií (viditelných pouze v mikroskopu) urychluje stanovení -mikrokolonie jsou obarveny vhodným fluorescenčním barvivem a pozorovány pod mikroskopem už během 1�-2� dne od inokulace� Kombinace techniky mikrokolonií se specifickou detekcí (např� fluorescenční in situ hybridizace se specifickými sondami) pak umožní i identifikaci pomalu rostoucích kontaminant do úrovně druhu během velmi krátké doby (Asano et al�, 2009)� V souvislosti s mikrobiologickými analýzami piva byla u někte-rých laktobacilů popsána obtížná kultivovatelnost, nebo tzv� "stav obtížné kultivace" (tzv� hard-to-culture state), či stav "životaschop-nosti ale nekultivovatelnosti" (tzv� VBNC; viable but nonculturable), který je indukován při naočkování bakterií z piva na médium neobsahující pivo, a souvisí s adaptací bakterií na podmínky v pivu� Při opakovaném přeočkování na půdě bez piva postupně narůstá jejich schopnost růstu na běžné půdě, jak bylo zjištěno např� u L. lindneri, L. paracollinoides a L. acetotolerans (Deng et al�, 2014;Suzuki et al�, 2004;2006a)� Tzv� VBNC fenotyp, který je charakterizován neschopností buněk množit se na růstovém médiu, přestože jsou živé a udržují si metabolickou aktivitu, je běžným jevem a vyskytuje se u bakterií, které jsou vysoce adaptované na podmínky prostředí, v němž se vyskytují před přenesením na standardní živnou půdu (Oliver, 2005)� V článku je často popisována schopnost mléčných bakterií kazit pivo� Pokud uvádíme termín "škodlivost", je i tímto ...…”

“…3, komplexní médium obsahující maltosu a fruktosu, bylo navrženo pro detekci mléčných bakterií (Saha et al�, 1974)� V porovnání s UBA, WLD a půdou z rajčatového džusu na ní mléčné bakterie rostly rychleji a tvořily větší kolonie (Casey and Ingledew, 1981)� Půda je doporučována Evropskou pivovarskou konvencí (European Brewery Convention; EBC) k rutinním kontrolám piva a pivovarského provozu� Neobsahuje pivo a její součástí jsou maltosa a fruktosa� Není dostatečně selektivní vůči bakteriím, které nekazí pivo, současně má menší záchyt pivu škodících mléčných bakterií, a proto má spíše informativní význam (Jespersen a Jakobsen, 1996)� Médium je používáno ve srovnávacích studiích (Crumplen et al�, 1991;Suzuki et al�, 2008b;Taskila et al�, 2011)� Hsuovo Lactobacillus-Pediococcus médium (HLP-médium, HLPM) ve ztužené nebo poloztužené formě bylo navrženo pro identifikaci bakterií mléčného kvašení (Hsu et al�, 1975 Leeho multidiferenciální agar (Lee's multidifferential agar, LMDA) je živné médium, které umožňuje detekci běžných mikroorganismů vyskytujících se v prostředí pivovaru, včetně pivu škodících bakterií� Médium není plně selektivní, přídavkem aktidionu lze zabrá-nit růstu kvasinek� LMDA obsahuje bromkresolovou zeleň a uhličitan vápenatý -křídu� Ve vodě nerozpustná křída vytváří v agaru mléčný zákal, který se v případě produkce kyselin rozpustí a kolem kolonií se vytvoří zřetelné "vyčeřené zóny" způsobené vznikem octanu vá-penatého, který již je ve vodě rozpustný; při použití bromkresolové zeleně dochází k probarvení média v okolí kolonií vlivem změny pH a také k různému zbarvení kolonií v důsledku zadržování barvičky� Nastavením kultivačních podmínek lze rozlišit bakterie produkující kyseliny -kultivace za aerobních podmínek dovoluje růst octových bakterií a za anaerobních podmínek pediokoků a laktobacilů (Lee et al�, 1975)� Jednoduchým a levným médiem pro růst laktobacilů a pediokoků nacházejících se v pivovarském provoze je sacharosový agar (Sucrose agar), který však je ve své základní formě neselektivní a umož-ňuje růst i ostatních pivu škodících organismů (Boatwright a Kirsop, 1976)� Autoři uvádějí různé možnosti modifikace sacharosového agaru, např� přídavek práškové křídy a/nebo bromkresolové zeleně pro zvýšení kontrastu mezi koloniemi a agarem� Přídavek mikrobiál-ních inhibitorů (aktidion, β-fenylethanol) umožní zvýšení selektivity média pro mléčné bakterie� V roce 1978 byla půda mezi metodami doporučovanými EBC pro detekci mléčných bakterií při pivovarské kontrole� V jiných studiích je však použitelnost sacharosového agaru pro účely detekce mléčných bakterií zpochybňována -u různých druhů a kmenů byla pozorována různá schopnost utilizace sacharosy a jiných cukrů (Lawrence a Leedham, 1979)� MRS agar modifikovaný přídavkem 0,5 % maltosy (tzv� MRS+M agar) byl porovnáván s WLD, standardním MRS, UBA a LMD-agary� Půda obsahující zároveň glukosu a maltosu zachycuje větší spektrum mléčných bakterií než ostatní uvedené půdy a je také vhodnější než sacharosový agar (Lawrence a Leedham, 1979)� Půda NBB byla původně vyvinuta Backem (1980) jako základní nespecifické médium� Její složení bylo dále upraveno tak, aby poskytla rychlejší výsledky a umožnila větší záchyt pivu škodících mikroorganismů než VLB-S7 ...…”