Enhancement of ?-amylase production by integrating and amplifying the ?-amylase gene of Bacillus amyloliquefaciens in the genome of Bacillus subtilis

Kallio, Pauli T.; Palva, Airi; Palva, Ilkka

doi:10.1007/bf00257255

Cited by 29 publications

(18 citation statements)

References 32 publications

Supporting

Mentioning

Contrasting

Unclassified

Order By: Relevance

“…The 1.7-kb EcoRI-BamHI fragment of pKTH3327 containing the P spac -controlled prsA (P spac -prsA) and P penP -lacI genes were inserted between the respective sites of pKTH1601 to construct pKTH3362. pKTH3362 also carries a 0.9-kb fragment of the ywlG region of the B. subtilis chromosome (24), enabling integration of the plasmid into the chromosome by a Campbell-type mechanism (10,11,20). A prsA3 mutant, IH6525, was transformed with pKTH3362 for Cm r to obtain IH7118, and isopropyl-␤-Dthiogalactopyranoside (IPTG)-dependent expression of P spac -prsA and complementation of the prsA3 mutation was confirmed.…”

Section: Methodsmentioning

confidence: 99%

Quantitation of the Capacity of the Secretion Apparatus and Requirement for PrsA in Growth and Secretion of α-Amylase in Bacillus subtilis

et al. 2001

View full text Add to dashboard Cite

Regulated expression of AmyQ ␣-amylase of Bacillus amyloliquefaciens was used to examine the capacity of the protein secretion apparatus of B. subtilis. One B. subtilis cell was found to secrete maximally 10 fg of AmyQ per h. The signal peptidase SipT limits the rate of processing of the signal peptide. Another limit is set by PrsA lipoprotein. The wild-type level of PrsA was found to be 2 ؋ 10 4 molecules per cell. Decreasing the cellular level of PrsA did not decrease the capacity of the protein translocation or signal peptide processing steps but dramatically affected secretion in a posttranslocational step. There was a linear correlation between the number of cellular PrsA molecules and the number of secreted AmyQ molecules over a wide range of prsA and amyQ expression levels. Significantly, even when amyQ was expressed at low levels, overproduction of PrsA enhanced its secretion. The finding is consistent with a reversible interaction between PrsA and AmyQ. The high cellular level of PrsA suggests a chaperone-like function. PrsA was also found to be essential for the viability of B. subtilis. Drastic depletion of PrsA resulted in altered cellular morphology and ultimately in cell death.Proteins synthesized with a signal peptide are secreted from bacterial cells by the action of the protein secretion apparatus, which consists of several components involved in protein targeting, translocation, signal peptide processing, and posttranslocational folding (4, 7). Extensive studies of Escherichia coli and Bacillus subtilis have identified and characterized to a substantial extent the components of the apparatus that translocates secretory proteins across the cytoplasmic membrane. In B. subtilis, they include the SecY, SecE, and SecG proteins, which form the core of the translocation channel or translocator (30,47) and are associated in the membrane with the SecDF protein (3). Furthermore, there are several signal peptidases (43, 45). The role of SecA ATPase on the cis side of the membrane in targeting and coupling the energy required for translocation has been well established (15,48). Many components of the secretion apparatus are known to be under temporal control; their maximal level of expression parallels the onset of protein secretion in the early stationary growth phase (15, 43).The stages of protein secretion that take place outside the cytoplasmic membrane are less well understood. A central feature of secretion is posttranslocational folding. The correct folding of many secreted proteins is not spontaneous but dependent on assisting folding factors. In E. coli they include protein-specific chaperones, periplasmic peptidyl-prolyl cis/trans isomerases, and enzymes (Dsb proteins) involved in the formation and rearrangement of disulfide bonds (8,16,19,31,32). The depletion of foldases such as SurA and PpiD causes misfolding stress that activates the E -and cpx-dependent stress response (5,6,31). This results in the induction of expression of the periplasmic protease and foldases (6, 37), often resulting in t...

show abstract

Section: Methodsmentioning

confidence: 99%

Quantitation of the Capacity of the Secretion Apparatus and Requirement for PrsA in Growth and Secretion of α-Amylase in Bacillus subtilis

et al. 2001

View full text Add to dashboard Cite

show abstract

“…Among other systems, integration of (parts of) nonreplicating heterologous plasmids by means of Campbell-type integration or replacement recombination is a powerful tool to obtain mutants, and this methodology has been used in Escherichia coli and Bacillus subtilis (6,20,22,25). An additional advantage of plasmid integration strategies is that they can also be used to stabilize plasmid-borne genes in the chromosomes of bacterial species (1,10,11,24).…”

mentioning

confidence: 99%

Replacement recombination in Lactococcus lactis

Leenhouts

Venema

1991

J Bacteriol

View full text Add to dashboard Cite

In the pUC18-derived integration plasmid pML336 there is a 5.3-kb chromosomal DNA fragment that carries the X-prolyl dipeptidyl aminopeptidase gene (pepXP). The gene was inactivated by the insertion of an erythromycin resistance determinant into its coding sequence. Covalently closed circular DNA of pML336 was used for the electrotransformation of Lactococcus lactis. In 2% of the erythromycin-resistant transformants the pepXP gene was inactivated by a double-crossover event (replacement recombination) between pML336 and the L. lactis chromosome. The other transformants in which the pepXP gene had not been inactivated carried a

show abstract

“…Vì vậy, nhiều tác giả đã chọn hệ biểu hiện B. subtilis để sản xuất protein tái tổ hợp. Nhiều nghiên cứu cho thấy B. subtilis biểu hiện các enzyme tái tổ hợp cho sản lượng cao [1,9,12,15]. Trước đây, pectate lyase từ B. subtilis đã được biểu hiện trong E. coli nhưng mức độ biểu hiện rất thấp (1 U/ml) [7].…”

Section: Biến Nạp Plasmid đA Copy Pmse3/bapro-pel Vào B Subtilis 168unclassified

High level expression of a gene coding for pectate lyase in Bacillus subtilis 168

Bac¹,

Hang²,

Tài³

et al. 2013

V J Bio

View full text Add to dashboard Cite

TÓM TẮT: Pectate lyase là enzyme phân hủy polygalacturonate của vách tế bào thực vật tạo ra các oligogalacturonates. Những năm gần đây, pectate lyase đã được nhiều nhà khoa học quan tâm bởi những tiềm năng ứng dụng to lớn của chúng trong công nghiệp dệt, công nghiệp sản xuất bột giấy. Gen pel mã hóa cho pectate lyase từ Bacillus subtilis VBS11 đã được dung hợp với promoter α-amylase của B. amyloliquefaciens. Thiết kế này được gắn vào vector pMSE3 và biến nạp vào chủng biểu hiện Bacillus subtilis 168 để biểu hiện gen với sự điều khiển của promoter BApro từ Bacillus amyloliquefaciens. Sau khi biểu hiện, lượng pectate lyase được tiết ra với mức độ cao, đạt 88,6 U/ml trên môi trường BMM.Từ khóa: Bacillus, expression, pectate lyase, promoter. MỞ ĐẦUEndo pectate lyase (Pel), (EC 4.2.2.2) là một pectinase kiềm phân hủy polygalacturonate tạo ra các oligogalacturonate. Enzyme này phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1,4 glycosidic của polygalacturonate trong thành tế bào thực vật thông qua phản ứng ß-elimination tạo ra các oligogalacturonate có liên kết đôi giữa C4 và C5 ở đầu đường không khử [3]. Trong công nghiệp dệt Pel có ứng dụng quan trọng là loại bỏ pectin trong vải bông thô, do đó có thể thay thế chất kiềm trong khâu nấu kiềm, làm tăng chất lượng của vải bông và giảm thiểu ô nhiễm môi trường do chất kiềm gây ra [4,6,10,11,14]. Ngoài ra Pel còn được ứng dụng trong công nghệ sản xuất bột giấy, tạo ra bột giấy chất lượng cao để dùng sản xuất các loại giấy cao cấp. Gene pectate lyase (pel) từ B. subtilis đã được biểu hiện trong E. coli nhưng mức độ biểu hiện rất thấp (chỉ đạt 1 U/ml) [7]. Gần đây, gene pectate lyase từ B. subtilis WSHB04-02 đã được biểu hiện trong nấm men P. pastoris cho hoạt tính cao đạt 100 U/ml [16]. Tuy nhiên, với hệ biểu hiện nấm men đòi hỏi thời gian lên men lâu, môi trường lên men giàu dinh dưỡng cho nên giá thành sẽ cao, vì vậy việc đi tìm một hệ biểu hiện mạnh để biểu hiện Pel tái tổ hợp đủ lớn phục vụ cho công nghiệp là rất cần thiết. Trong bài báo này chúng tôi công bố kết quả biểu hiện gen pel của chủng B. subtilis VBS11 phân lập từ Việt Nam dưới sự điều khiển của promoter α-amylase từ B. amyloliquefaciens (BApro) sử dụng chủng biểu hiện B. subtilis 168. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệuChủng vi sinh vật: Chủng Bacillus subtilis 168 (BS168) đựơc sử dụng làm chủng biểu hiện gen.Các môi trường nuôi cấy: Môi trường nuôi cấy B. subtilis: LB (1% Tryptone, 0,5% Yeast extract, 1% NaCl). Môi trường LB và môi trường tối thiểu Belisky được sử dụng làm môi trường biểu hiện PL trong BS168. Kháng sinh kanamycin (Km) được bổ sung vào môi trường nồng độ 10 µg/ml khi cần thiết.Plasmid, primer: Plasmid đa copy pMSE3 được sử dụng làm vector biểu hiện chủng BS168. Gen pectate lyase (pel) sử dụng trong biểu hiện từ chủng B. subtilis VBS11 đã được tách dòng và giải trình tự trong công bố trước đây [8]. Trình tự primer để nhân gen pel gồm cặp 1: BSpelF-HindIII: atcgaagctt atgaaaaaag tgatgttagc và BSpelR-HindIII: atga agctttactg ctgactgtt với gen được nhân lên là pel; cặp 2: pel-BApro-pMSE-XhoIf: acttctcgag...

show abstract

Enhancement of ?-amylase production by integrating and amplifying the ?-amylase gene of Bacillus amyloliquefaciens in the genome of Bacillus subtilis

Cited by 29 publications

References 32 publications

Quantitation of the Capacity of the Secretion Apparatus and Requirement for PrsA in Growth and Secretion of α-Amylase in Bacillus subtilis

Quantitation of the Capacity of the Secretion Apparatus and Requirement for PrsA in Growth and Secretion of α-Amylase in Bacillus subtilis

Replacement recombination in Lactococcus lactis

High level expression of a gene coding for pectate lyase in Bacillus subtilis 168

Contact Info

Product

Resources

About