Easy and efficient protocol for oomycete DNA extraction suitable for population genetic analysis

Abstract

Purpose of workA simple and rapid DNA extraction protocol capable of obtaining high-quality and quantity DNA from a large number of individuals is essential for assaying population and phylogenetic studies of plant pathogens. Most DNA extraction protocols used with oomycetes are relatively lengthy and cumbersome for high throughput analysis. Commercial kits are widely used, but low quantities of DNA are usually obtained, and with large scale analysis multiple isolations are required.A protocol for DNA isolation from Phytophthora and Pythium suitable for the evaluation of a large set of molecular markers was modified from one previously developed for soybean seed. There was a one to three fold increase in the amount of DNA that was extracted using the modified protocol compared to a commercial kit. The DNA obtained using the modified protocol was suitable for the amplification of microsatellite markers as well as the ITS region. This protocol is inexpensive, easy, quick, and efficient in terms of the volume of reagents and the number of steps involved in the procedure. The method may be applicable to other oomycetes and effectively implemented in other laboratories.

Molecular Tools for Detection of Plant Pathogenic Fungi and Fungicide Resistance

“…Many published protocols are available to ensure an efficient and reproducible method for DNA extraction from plants (revised by Demeke and Jenkins, 2010;Biswas and Biswas, 2011); from fungi (Chi et al, 2009;Feng et al, 2010;González-Mendoza et al, 2010;Niu et al, 2008;Zelaya-Molina et al, 2011;Zhang, Y. J. et al, 2010); and from soil (revised by Hirsch et al, 2010).…”

Phytophthora hydropathica y Phytophthora drechsleri aisladas de canales de irrigación del Valle de Culiacán

“…A partir del micelio producido, se realizó la extracción de ADN; para esto, se utilizó un amortiguador de digestión (Tris/HCl, 10 mM, pH 8.0; EDTA, 50 mM; SDS, 0.5 %; Triton X-100, 0.5 %; Tween 20, 0.5 %) y 2 µL de proteinasa K (20 mg/ mL), seguido de una serie de lavados con cloroformo-alcohol isoamílico (Zelaya-Molina et al, 2011). Para la caracterización de los aislamientos, se utilizaron los iniciadores DC6 (5'-GAGGGACTTTT-GGGTAATCA-3') (Bonants et al, 1997) e ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') (White et al, 1990) para amplificar la región que flanquea el ITS de un tamaño aproximado de 1300 pb y los iniciadores ELONGF1 (5´-TCACGATCGACATT-GCCCTG-3´) y ELONGR1 (5´-ACGGCTCGAG-GATGACCATG-3´) que amplifican un fragmento aproximado de 970 pb de la región central del gen que codifica para el factor de elongación 1-α en la cual no se incluyen intrones (Kroon et al, 2004).…”

“…Para la caracterización de los aislamientos, se utilizaron los iniciadores DC6 (5'-GAGGGACTTTT-GGGTAATCA-3') (Bonants et al, 1997) e ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') (White et al, 1990) para amplificar la región que flanquea el ITS de un tamaño aproximado de 1300 pb y los iniciadores ELONGF1 (5´-TCACGATCGACATT-GCCCTG-3´) y ELONGR1 (5´-ACGGCTCGAG-GATGACCATG-3´) que amplifican un fragmento aproximado de 970 pb de la región central del gen que codifica para el factor de elongación 1-α en la cual no se incluyen intrones (Kroon et al, 2004). La concentración final de la mezcla para la PCR, consistió de: amortiguador 1X, dNTPs 0.2 mM, 50 mM; SDS, 0.5 %; Triton X-100, 0.5 %; Tween 20, 0.5 %) and 2 µL of K proteinase (20 mg/mL), followed by a series of washings with chloroformisoamylalcohol (Zelaya-Molina et al, 2011). For the characterization of the isolates, the primers DC6…”

Caracterización de Phytophthora nicotianae causante de tizón de vinca en áreas urbanas y viveros de ornamentales en Culiacán, México

“…The DNA was extracted using the protocol proposed by Zelaya-Molina et al (2011), which consists of a series of washings with chloroform-isoamyl alcohol. A group of 10 sexual, cada aislado se confrontó con cepas de referencia A1 y A2 de P. nicotianae en medio de cultivo V8; un disco de 0.5 cm de diámetro de agar con micelio en crecimiento activo de cada aislado se colocó a una distancia aproximada de 1 cm de distancia de discos de agar con micelio en crecimiento activo de las cepas de referencia A1 y A2 de P. nicotianae.…”

“…El ADN se extrajo utilizando el protocolo propuesto por Zelaya-Molina et al (2011), el cual consiste en una serie de lavados con cloroformo-alcohol isoamílico. Un grupo de 10 aislados representativos que comparten características morfológicas se utilizaron para amplificar el ADN con los pares de oligonucleótidos ELONGF1 (5´-TCACGATCGA-CATTGCCCTG-3´) y ELONGR1 (5´-ACGGCTC-GAGGATGACCATG-3´) para TEF-1α, TUBUF2 (5´-CGGTAACAACTGGGCCAAGG-3´) y TU-BUR1 (5´-CCTGGTACTGCTGGTACTCAG-3´) para beta tubulina (Kroon et al, 2004) y los oligonucleótidos DC6 (5´-GAGGGACTTTTGGGTA-ATCA-3´) e ITS4 (5´-TCCTCCGCTTATTGATAT-GC-3´) para la región ITS (Bonants et al, 1997).…”