The present study aimed to evaluate the persistence of kanamycin in lactating Anatolian buffalo milk followed by an intramuscular injection of kanamycin. The collection of milk samples was performed twice daily up to the 10th milking followed by kanamycin injection and liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was employed for the residue analysis. The detection limit of the method was determined as 3.56 μg/kg. The highest concentrations of kanamycin were determined in the first milking after injection and mean concentration of this milking was found to be as 1473 μg/kg. Kanamycin residue in all buffalo milk samples was lower than the maximum residue limit (150 μg/kg) with the fifth milking. In addition, a monitoring study was conducted to determine whether buffalo milk marketed in Afyonkarahisar pose a public health risk regarding kanamycin residue. The results of the monitoring study showed that one (2%) of the 50 buffalo milk samples contained kanamycin at the concentration of 22.36 μg/kg. In conclusion, this study determined the persistence of kanamycin in Anatolian buffalo milks based on an LC-MS/MS method. In addition, results of the study showed that buffalo milks marketed in Afyonkarahisar Province pose a very low risk regarding kanamycin residue.Bu çalışmada, laktasyondaki Anadolu mandalarına intramüsküler olarak kanamisin enjekte edilmesini takiben sütlerindeki kanamisin kalıntısının belirlenmesi amaçlandı. Süt numunelerinin toplanması, kanamisin enjeksiyonunu takiben günde iki kez 10'uncu sağıma kadar gerçekleştirildi ve kalıntı analizi için likit kromatografisi tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) kullanıldı. Metodun tespit limiti 3.56 μg/kg olarak belirlendi. En yüksek kanamisin konsantrasyonları enjeksiyondan sonraki ilk sağımda tespit edildi ve sağımdaki ortalama konsantrasyon 1473 μg/kg olarak belirlendi. Manda sütü örneklerinde kanamisin kalıntı düzeyinin beşinci sağımdan itibaren maksimum kalıntı sınırından (150 μg/kg) daha düşük olduğu belirlendi. Ayrıca, Afyonkarahisar'da pazarlanan manda sütlerinin kanamisin kalıntısı konusunda halk sağlığı açısından risk oluşturup oluşturmadığını belirlemek amacıyla bir saha taraması yapıldı. Saha taraması sonucunda 50 manda sütü örneğinden birinin (%2) 22.36 μg/kg konsantrasyonunda kanamisin içerdiği saptandı. Sonuç olarak bu çalışmada kanamisinin Anadolu manda sütlerinde kalıcılığı LC-MS/MS metodu ile belirlendi. Ayrıca, çalışmanın sonuçları Afyonkarahisar'da tüketime sunulan manda sütlerinin kanamisin kalıntısı açından çok düşük risk taşıdığını gösterdi.