Cyclization mechanism of phomopsene synthase: mass spectrometry based analysis of various site-specifically labeled terpenes

Abstract

Elucidation of the cyclization mechanism catalyzed by terpene synthases is important for the rational engineering of terpene cyclases. We developed a chemoenzymatic method for the synthesis of systematically deuterium-labeled geranylgeranyl diphosphate (GGPP), starting from site-specifically deuterium-labeled isopentenyl diphosphates (IPPs) using IPP isomerase and three prenyltransferases. We examined the cyclization mechanism of tetracyclic diterpene phomopsene with phomopsene synthase. A detailed EI-MS analysis of phomopsene labeled at various positions allowed us to propose the structures corresponding to the most intense peaks, and thus elucidate a cyclization mechanism involving double 1,2-alkyl shifts and a 1,2-hydride shift via a dolabelladien-15-yl cation. Our study demonstrated that this newly developed method is highly sensitive and provides sufficient information for a reliable assignment of the structures of fragmented ions.

Two Bacterial Diterpene Synthases from Allokutzneria albata Produce Bonnadiene, Phomopsene, and Allokutznerene

“…A similar sequence explains the formation of 3 from K through 1,2‐hydride migration to L , ring closure to M , and deprotonation. The mechanism for 2 was recently investigated by enzymatic synthesis of several deuterated GGPP isotopomers from deuterated IPPs, followed by cyclisation to 2 with PaPS and GC/MS analysis . The data interpretation in this study proved to be difficult because assumptions about the EI‐MS fragmentation mechanism of 2 had to be made to localise the incorporation sites of deuterium.…”

“…Them echanism for 2 was recently investigated by enzymatic synthesis of several deuterated GGPP isotopomers from deuterated IPPs,f ollowed by cyclisation to 2 with PaPS and GC/MS analysis. [16] Thed ata interpretation in this study proved to be difficult because assumptions about the EI-MS fragmentation mechanism of 2 had to be made to localise the incorporation sites of deuterium. Thee xperiments for the cyclisation mechanism towards 3 described here simultaneously allowed areinvestigation of the mechanism for 2.Incubation of all 20 isotopomers of ( 13 C)GGPP with PmS resulted in the incorporation of the label into the corresponding carbons of 2 and 3 in all cases, which provided evidence for the skeletal rearrangement from F to G (Figures S40 and S41).…”

Zwei bakterielle Diterpensynthasen aus Allokutzneria albata für Bonnadien sowie für Phomopsen und Allokutzneren

“…Eine ähnliche Sequenz erklärt die Bildung von 3 aus K durch 1,2‐Hydridwanderung zu L , Ringschluss zu M und Deprotonierung. Der Mechanismus für 2 wurde jüngst per enzymatischer Synthese diverser deuterierter Isotopomere von GGPP aus deuterierten IPPs und nachfolgender Cyclisierung zu 2 mit PaPS und GC/MS‐Analyse untersucht . Die Interpretation der Daten in dieser Studie erwies sich als schwierig, weil Annahmen über den EI‐MS‐Fragmentierungsmechanismus von 2 getroffen werden mussten, um die eingebauten Deuteriumatome zu lokalisieren.…”

“…Entsprechend zeigte die Inkubation von (3‐ 13 C,2‐ 2 H)FPP mit IPP, GGPPS und PmS die 1,2‐Hydridwanderung von K nach L in der Cyclisierung zu 3 und die Deprotonierung von C6 in der Cyclisierung zu 2 (Abbildung S43). In Summe bestätigten diese Experimente den Cyclisierungsmechanimus für 2 und gaben detaillierte Einblicke in den verwandten Mechanismus für 3 .…”

Diterpenbiosynthese in Actinomyceten: Studien an Cattleyensynthase und Phomopsensynthase

“…Frühe Studien von Djerassi wurden basierend auf synthetischen markierten Terpenen durchgeführt, während die Fütterung von markierten Vorläufern an wachsende Kulturen in lediglich partiell markierten Verbindungen resultiert . Jüngst wurden deuterierte Isotopomere von IPP für die enzymatische Synthese von 5 verwendet, um dessen Fragmentierungsmechanismus zu studieren . Die Umsetzung der zwanzig Isotopomere von ( 13 C)GGPP mit CyS ergab spezifisch markierte Isotopomere von 1 , für die die EI‐Massenspektren in Abbildung S78 gezeigt werden.…”