Zwei bakterielle Diterpensynthasen aus Allokutzneria albata für Bonnadien sowie für Phomopsen und Allokutzneren

Abstract

Zwei Diterpensynthasen aus Allokutzneria albata wurden auf ihre Produkte untersucht. Das Produkt des ersten Enzyms wurdea ls die neue Verbindung Bonnadien identifiziert. Obwohl das zweite Enzym phylogenetisch nichtm it der pilzlichen Phomopsen-Synthase in Verbindung steht, produzierte es eine Mischung aus Phomopsen und einer biosynthetisch verwandten neuen Verbindung,A llokutzneren, sowie Spiroviolen. Beide Enzyme wurden im Detail durch Isotopenmarkierungsexperimente,V ariation des Metallcofaktors und ortsgerichtete Mutagenese auf ihren Mechanismus untersucht.O xidationsprodukte von Phomopsen und Allokutzneren werden ebenfalls diskutiert. Schema 1. Bonnadien( 1). A) Strukturaufklärung (fett: 1 H, 1 H-COSY-Korrelationen, einfache Pfeile:HMBC-Korrelationen, Doppelpfeile: NOESY-Korrelationen) und Kohlenstoffnummerierung(zeigt den Ursprung fürjedes Kohlenstoffatom aus GGPP durch dieselbe Nummer). B) Cyclisierung von GGPP zu 1 durch BdS.

Bacterial Diterpene Biosynthesis

“…Ab acterial DTS from Allokutzneria albata with weak homology to SvS (34 %i dentical residues) converts GGPP into am ixture of the known fungal compound phomopsene (6) [33] and the new diterpene allokutznerene (7), together with traces of 5. [34] Thef ormation of 5 indicated af irst cyclisation step from GGPP to A5 + ,w hich is also ar easonable intermediate on the pathway to 6 and 7 (Scheme 5). Starting from A5 + ,aconcerted ring expansion/ring contraction and 2,10cyclisation to B6 + ,followed by a1,2-hydride shift to C6 + ,2,6cyclisation to D6 + ,and deprotonation yields 6.Avery similar sequence of steps including an alternative 6,10-cyclisation from A5 + to B7 + and subsequent 1,2-hydride shift to C7 + ,2,6cyclisation to D7 + ,a nd deprotonation gives rise to 7.T his mechanism was supported by labelling experiments with all twenty ( 13 C)GGPP isotopomers.T he substrates (3-13 C,2-2 H)GGPP and (7-13 C,6-2 H)GGPP,e nzymatically prepared from (3-13 C,2-2 H)FPP and IPP with GGPPS,e lucidated the 1,2-hydride shifts and deprotonation steps along the cationic cascade towards 6 and 7.N otably,t he DTS from A. albata is unrelated to the phomopsene synthase from Phomopsis amygdali, [33] thus suggesting convergent evolution leading to privileged diterpene structures.…”

“…As econd DTS from A. albata converts GGPP into the new diterpene bonnadiene (8,S cheme 6). [34] Fori ts structure elucidation, ( 13 C 5 )IPP was synthesised and used for the GGPPS-catalysed elongation of ( 13 C 15 )FPP to ( 13 C 20 )GGPP.…”

A Clade II‐D Fungal Chimeric Diterpene Synthase from Colletotrichum gloeosporioides Produces Dolasta‐1(15),8‐diene

“…[16] Thedeuterium atoms were incorporated into the diastereotopic positions in line with the absolute configuration of (5R,12R,14S)-1.T he 13 Cl abels in the used probes were introduced for sensitive detection by HSQC spectroscopy ( Figures S22 and S23). Further confirmation was obtained using DMAPP and (E)-and (Z)-(4-13 C,4-2 H)IPP, [17] which were converted into the corresponding GGPP isotopomers by the PT domain of CgDS with known stereochemical course (Si face attack at C-4 of IPP). [18] Cyclization by the TS domain gave incorporation of deuterium into positions that were again indicative of an absolute configuration of (5R,12R,14S)-1 ( Figure S24).…”

Eine chimäre pilzliche Diterpensynthase der Klade II‐D aus Colletotrichum gloeosporioides produziert Dolasta‐1(15),8‐dien

“…Um die Funktion von Cgl13742 in vitro zu charakterisieren, wurde das Gen Cgl13742 durch PCR mit reverser Tr anskriptase amplifiziert und in den Expressionsvektor pET28a kloniert. (Z)-(4-13 C,4-2 H)IPP bestätigt, [17] die mit bekanntem stereochemischen Verlauf (Angriff an C-4 des IPP von der Si-Seite) [18] in die entsprechenden Isotopomere des GGPP überführt wurden. Inkubation von Cgl13742 mit Geranyl-(GPP) und Farnesyldiphosphat (FPP) ergab kein Produkt, während die Inkubation mit DMAPP und IPP oder mit GGPP in der Bildung von 1 neben Spuren eines zweiten Diterpens 2 resultierte (Abbildungen 1u nd S5).…”

“…Die Ergebnisse wurden weiterhin mit DMAPP und (E)-bzw. (Z)-(4-13 C,4-2 H)IPP bestätigt, [17] die mit bekanntem stereochemischen Verlauf (Angriff an C-4 des IPP von der Si-Seite) [18] in die entsprechenden Isotopomere des GGPP überführt wurden. Cyclisierung durch die TS-Domäne führte erneut zum Einbau des Deuteriums in Positionen, die auf die absolute Konfiguration von (5R,12R,14S)-1 hinwiesen (Abbildung S24).…”