Objetivo: Identificar o conhecimento de enfermeiros acerca do biofilme em feridas complexas. Método: Estudo descritivo e transversal, realizado em cinco unidades de internação de pacientes adultos em um hospital público de ensino no estado de Mato Grosso do Sul. Para a coleta de dados foi utilizado um instrumento semiestruturado, autoaplicável, composto por 26 questões. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em seres humanos da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul sob parecer número 3.727.518. Resultados: Participaram da pesquisa 52 profissionais, com média de idade de 37,63 anos e predomínio do sexo feminino. A maioria possuía experiência na área e atuava na unidade de urgência e emergência, no turno diurno e tinha como maior grau de formação a especialização. Quanto ao recebimento de treinamento acerca do biofilme, a maioria relatou não ter recebido. As perguntas com maior percentual de respostas incorretas estavam relacionadas ao diagnóstico e tratamento. Conclusão: Os participantes apresentaram limitações no conhecimento acerca do biofilme em feridas complexas, o que pode influenciar na prática clínica. Acredita-se que a falta de atividades voltadas ao ensino-aprendizagem na instituição tenha contribuído para estes resultados.