Calcium phosphate bions cause increased release of interleukin-6 and interleukin-8 in primary arterial endothelial cells regardless of their shape

Abstract

Актуальность. Кальций-фосфатные бионы (КФБ) формируются при перенасыщении крови ионами кальция и фосфора и, циркулируя в кровотоке, повреждают эндотелиальные клетки (ЭК), при растворении в лизосомах вызывая их лизосомально-опосредованную клеточную гибель, которая может сопровождаться выделением провоспалительных цитокинов в микроокружение. Цель исследования. Оценить профиль секреции провоспалительных цитокинов первичными артериальными ЭК человека под воздействием сферических КФБ (СКФБ) и игольчатых КФБ (ИКФБ). Материалы и методы. СКФБ и ИКФБ в равных концентрациях (100 мкл, оптическая плотность суспензии на длине волны 650 нм 0,08-0,10) были добавлены к конфлюэнтным культурам первичных ЭК коронарной и внутренней грудной артерии человека в 6-луночных планшетах. Культуральная жидкость забиралась после 24 часов культивирования с последующим измерением в ней уровня провоспалительных цитокинов (интерлейкин(ИЛ)-1β, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-23, фактор некроза опухоли-α, γ-интерферон) посредством иммуноферментного анализа. Кроме того, из клеточной массы выделяли РНК посредством соответствующих колонок с последующей обратной транскрипцией для синтеза кДНК и оценкой экспрессии генов, кодирующих вышеуказанные цитокины (IL1B, IL6, CXCL8, IL10, IL12A, IL12B, IL23, TNF, IFNG) и некоторые рецепторы к ним (IL1R1, IL1R2, TNFRSF1A, TNFRSF1B), методом количественной полимеразной цепной реакции. Результаты. Воздействие СКФБ и ИКФБ приводило к статистически значимому повышению экспрессии генов IL1B, IL6, CXCL8, IL12A и IL23, при этом ЭК коронарной артерии характеризовались более выраженным ответом на воздействие КФБ на уровне транскриптов в сравнении с ЭК внутренней грудной артерии. Хотя воздействие ИКФБ в большинстве случаев приводило к более выраженному увеличению экспрессии генов цитокинов в сравнении с СКФБ, на уровне белков эта зависимость от формы бионов не наблюдалась. Экспозиция СКФБ и ИКФБ приводила к повышению выделения ИЛ-6 обоими типами артериальных ЭК, в то время как повышенная секреция ИЛ-8 наблюдалась лишь при экспозиции ИКФБ ЭК внутренней грудной артерии. Заключение. Добавление КФБ к культурам первичных артериальных ЭК способствует выделению этими клетками провоспалительных цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-8 в результате повышения экспрессии генов (IL6 и CXCL8 соответственно) независимо от формы КФБ (сферической или игольчатой). Background. Calcium phosphate bions are formed under blood supersaturation with calcium and phosphate. Circulating bions provoke endothelial injury via lysosome-dependent cell death accompanied by release of proinflammatory cytokines into the microenvironment. Aim. To evaluate the cytokine secretion profile of human primary arterial endothelial cells (ECs) exposed to either spherical (CPB-S) or needle-shaped (CPB-N) calcium phosphate bions. Materials and Methods. CPB-S and CPB-N were added at equal concentrations (100 µL, optical density 0.08-0.10, at 650 nm wavelength) to confluent cultures of primary coronary artery (HCAEC) and internal thoracic artery (HITAEC) endothelial cells in 6-well plates. At 24 h of culture, the cell culture supernatant was collected, and respective cytokines (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-23, tumor necrosis factor-α, and γ-interferon) were measured by an enzyme-linked immunosorbent assay. Expression of cytokine (IL1B, IL6, CXCL8, IL10, IL12A, IL12B, IL23, TNF, IFNG) and cytokine receptor genes (IL1R1, IL1R2, TNFRSF1A, TNFRSF1B) was quantified with the reverse transcription-polymerase chain reaction. Results. Exposure to both CPB-S and CPB-N led to statistically significant increases in the expression of IL1B, IL6, CXCL8, IL12A, and IL23 genes. HCAEC were characterized by a greater response to CPB at the transcript level compared to HITAEC. Although CPB-N induced a more pronounced cytokine response than CPB-S, such shape-dependent effects were negligible at the protein level. The exposure to CPB-S and CPB-N resulted in elevated release of interleukin-6 by both types of arterial ECs while the interleukin-8 release was augmented exclusively in response to the CPB-N exposure of HITAEC. Conclusion. Exposure of primary arterial ECs to CPB induced the release of IL-6 and IL-8 due to the expression of respective genes regardless of the CPB shape (spherical or needle-shaped).