Jamu pegal linu serbuk instan merupakan jamu yang banyak dikonsumsi masyarakat Indonesia, umumnya dibuat dari campuran rempah dan gula serta memiliki kelebihan bersifat praktis dalam penyajian, mudah dibawa dan memiliki daya simpan relatif lama. Akan tetapi, pengolahan jamu pegal linu serbuk instan yang kurang baik dapat menyebabkan kontaminasi atau cemaran mikroba seperti kapang dan khamir. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui cemaran kapang dan khamir yang terdapat di dalam jamu pegal linu serbuk instan khususnya di pasar Nguter Kabupaten Sukoharjo. Tahapan yang dilakukan dalam penelitian ini adalah pengambilan sembilan sampel jamu pegal linu serbuk instan di pasar Nguter, preparasi alat dan bahan, homogenisasi dan pengenceran sampel, dan analisis uji angka kapang dan khamir di Laboratorium Kesehatan Sukoharjo. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa angka kapang dan khamir yang terdapat dalam sampel jamu A 6x10 1 koloni/g, jamu B 3,7x10 3 koloni/g, jamu C 2x10 2 koloni/g, jamu D 4x10 3 koloni/g, jamu E 2,4x10 4 koloni/g, jamu F 8x10 2 koloni/g, jamu G 1,5x10 2 koloni/g, jamu H 1,7x10 1 koloni/g, dan jamu I 1,3x10 3 koloni/g. Hasil angka kapang khamir yang diperoleh dari sembilan sampel, delapan sampel memenuhi standar BPOM RI Nomor 12 Tahun 2014 yaitu ≤10 4 , sehingga aman dikonsumsi dan satu sampel tidak memenuhi standar, sehingga tidak layak untuk dikonsumsi dan dipasarkan.