Adapting the reducing sugars method with dinitrosalicylic acid to microtiter plates and microwave heating

Abstract

Um método estável, confiável, eficiente com relação a tempo e custo para detecção de açúcares redutores, baseado no método colorimétrico do ácido dinitrossalicílico (DNS), adaptado para placas de microtitulação em um banho de água modificado com tratamento de microondas é proposto. Além da influência benéfica sobre o meio ambiente devido à redução do volume dos reagentes utilizados, o método modificado é rápido e permite a análise de um número relativamente alto de amostras. Pode ser aplicado em diversos tipos de laboratórios, de processamento de alimentos à indústrias farmacêuticas. O método adaptado foi parcialmente validado (intervalo de linearidade entre 7 µg e 5 mg per poço; limite de detecção 3 µg per poço, desvio padrão em torno de 5% para curvas de calibração com glucose, e recuperação superior a 90%) e aplicado à séries de produtos contendo açúcares redutores, como amostras de mel e vinho e medicamentos que contêm lactose como excipiente. O método proposto é bem adaptado como uma técnica de alto rendimento para determinação de açúcares redutores, pois todas amostras analisadas deram resultados esperados de acordo com as suas notas técnicas.A sound, reliable, time-and cost-efficient method for detection of reducing sugars, based on the well known dinitrosalicylic acid (DNS) colorimetric method, adapted for microtiter plates, in a modified water bath with microwave treatment is proposed. Besides the benefic influence on the environment due to the reduction of the volume of the reagents, the modified method is rapid and allows the analysis of a relatively high number of samples. It can be applied in many types of laboratories from food processing to pharmaceutical industries. The adapted method was partially validated (linearity range between 7 µg and 5 mg per well; limit of detection 3 µg per well, standard deviation around 5% for calibration curves with glucose, and a recovery higher than 90%) and applied to a series of products containing reducing sugars, such as honey, wine samples and drugs containing lactose as an excipient. The proposed method is well-suited as a high-throughput technique for determination of reducing sugars as all the analyzed samples gave the expected results according with their technical notes.Keywords: dinitrosalicylic acid (DNS), microtiter plate assay, microwave supported reaction, reducing sugars IntroductionMonosaccharides, most of oligosaccharides, glucose polymers, such as starch and cellulose, and copolymers, like chitin, contain reducing ends. The measurements of the concentration of reducing ends can give valuable information about the analyzed sample. 1 Especially due to their presence in many natural products, reducing sugars (RS) have received considerable attention, which lead to a growing number of methods for their assay. The ability to measure the concentration of RS bears much significance for understanding the amount of sugar in foodstuffs, in beverages and even, although indirectly, the activities of some enzymes which are responsible for the hydrolysis of po...

A simple automated microplate method for determining reducing sugars in food extracts and synthetic serum using cupric-neocuproine as reductant

“…Similarly, microwave heating was applied to accelerate the reaction in the microplate-based DNS method. 17 In addition, the necessity of the use of heat-resistant microplates and of special precautions taken for heating are serious drawbacks. It was also emphasized that the final solution should be filled and drained several times by pipetting to prevent bubble formation after the addition of colorant reagent in the microplate-based SN method.…”

“…Negrulescu et al also applied the microplate version of the DNS method. 17 This application differs from the previous one in that the heating process is carried out in a microwave oven. The system used for the reaction consisted of a plastic vessel filled with water, as thermal buffer, containing the microtiter plate placed in a polystyrene support.…”

Dosagem de açúcares redutores com o reativo DNS em microplaca

“…Além disso, no caso do vinho, por exemplo, a detecção desses açúcares redutores no produto final pode ser necessária para a classificação da bebida em seca, semiseca ou suave (FERNÁNDEZ-NOVALES et al, 2009;NEGRULESCU et al, 2012). Do mesmo modo, pesquisas realizadas nas áreas de fermentação e de química de carboidratos dependem de uma medição acurada dos níveis desses açúcares, sejam elas direta ou indiretamente ligadas ao interesse da indústria.…”

“…Mais tarde, Miller (1959) aperfeiçoou o ensaio, de modo que seu protocolo foi o mais empregado por muitos anos, com diversos fins, e o mais citado na literatura. O ácido 3,5-dinitrosalicílico (agente oxidante presente no reativo DNS), sob condições alcalinas, reage com o carbono carbonílico de açúcares redutores e se reduz a ácido 3-amino-5-nitrosalicílico, um composto corado cuja absorção máxima de luz se dá a 540 nm (GONÇALVES et al, 2010;NEGRULESCU et al, 2012).…”

“…Com exceção do protocolo padronizado por Gonçalves et al (2010), entretanto, todos os demais protocolos em microplaca demandam de 2,4 a 6,8 vezes mais reagente por amostra analisada em comparação ao método proposto (DECKER et al, 2003;XIAO et al, 2004XIAO et al, , 2005KING et al, 2009;NAVARRO et al, 2010;RAMADA et al, 2010;NEGRULESCU et al, 2012;WOOD et al, 2012;KIM et al, 2014). O protocolo de Gonçalves et al (2010), por outro lado, embora utilize os mesmos 25 µL de DNS empregados em nosso método, demanda o dobro de tempo de incubação destinado à reação de redução do ácido 3,5-dinitrosalisílico pelo açúcar (para geração da Santos, A.…”