A single-tube multiplex PCR for rapid detection in feces of 10 viruses causing diarrhea

Khamrin, Pattara; Okame, Makiko; Thongprachum, Aksara; Nantachit, Nattika; Nishimura, Shigeyuki; Okitsu, Shoko; Maneekarn, Niwat; Ushijima, Hiroshi

doi:10.1016/j.jviromet.2011.02.012

Cited by 80 publications

(58 citation statements)

References 14 publications

Supporting

Mentioning

Contrasting

Unclassified

Order By: Relevance

“…Araştırılacak olan gastroenterit viruslarının RNA-DNA amplifikasyonları için kullanılan ve daha önce tarif edilmiş primer dizileri ile beklenen PCR ürün büyüklükleri Tablo I'de gösterildi 9,[12][13][14] . Örneklerden elde edilen cDNA'lardan internal kontrol amacıyla RNaz-L cDNA'sını tanımlamak için bu gene ait primer çifti kullanıldı (Tablo I).…”

Section: Pcr Yöntemiunclassified

“…Moleküler yöntemlerdeki gelişmelere bağlı olarak son yıllar-da tanımlanan Aichi virus, parechovirus ve enteroviruslar da, gastroenterit ile ilişkili yeni viruslar olarak bildirilmiştir 4,5 . Picornaviridae ailesine ait olan bu üç virusun, ishalli olgularda gösterilmelerine karşın, direkt olarak gastroenterit ile ilişkileri henüz netleşmemiştir 9 .…”

Section: Tanımlanan Virusların Toplam öRnek Sayısına Oranı* (N= 50)unclassified

“…Bu MRT-PCR setlerinin, adı geçen virusların tanımlanmasında etkin olarak çalıştığının gösterilmesinin yanı sıra, Khamrin ve arkadaşları 9 da tüm bu virus ailesini tanıyacak MRT-PCR yöntemi geliştirmişlerdir. Bizim çalışmamızda her ne kadar Khamrin ve arkadaşları 9 tarafından geliştirilen tek tüp MRT-PCR sistemini uygulama imkanının olmasına karşın, multipleks PCR yöntemlerinde ortaya çıkan arka planda oluşabilecek kirliliği önlemek ve özellikle elde edilecek PCR ürü-nünün dizi analizi ile tanımlanma gereğinden dolayı, her dışkı örneğinden elde edilen cDNA için, her virus için özgül primer çifti ile ayrı ayrı PCR işlemi yapılmıştır.…”

Section: Tanımlanan Virusların Toplam öRnek Sayısına Oranı* (N= 50)unclassified

“…Hızlı tanıda, pratik olması nedeniyle EIA veya immünokromatografik yöntemler tercih edilmektedir 7 . Buna karşın son yıllarda gerek tanı gerekse epidemiyolojik çalışmalarda, duyarlılık ve özgüllüklerinin yüksek olması nedeniyle PCR (RNA virusları için ters transkripsiyon-PCR; RT-PCR) yöntemleri kullanılmaya başlamıştır [8][9][10] . Bu çalışma-da, hastanemize ishal şikayeti ile başvuran, rutin bakteriyolojik ve parazitolojik analizleri negatif olan 5 yaş altındaki çocukların dışkı örneklerinde rotavirus, norovirus, sapovirus ve astrovirus gibi bilinen gastroenterit etkenlerinin yanı sıra, Aichi virus, parechovirus ve enterovirus gibi gastroenterit patolojisiyle ilişkisi henüz tam olarak netleşmemiş virusların varlığının PCR ile araştırılması amaçlanmıştır.…”

Section: Introductionunclassified

See 3 more Smart Citations

Investigation of Seven Different RNA Viruses Associated with Gastroenteritis in Children Under Five Years Old

Akhter¹,

Turegun²,

Kıyan³

et al. 2014

Mikrobiyol Bul

View full text Add to dashboard Cite

ÖZETKüçük çocuklarda ortaya çıkan gastroenteritlerde en sık rastlanılan etkenlerin viruslar olduğu bilinmektedir. Viral gastroenteritlerin klasik etkenleri olan rotavirus, norovirus, adenovirus tip 40/41, astrovirus ve sapovirus gibi virusların yanı sıra son yıllarda moleküler yöntemlerdeki gelişmelere bağlı olarak yeni tanımlanan bazı pikornavirusların (Aichi virus, parechovirus, enterovirus) da gastroenterit ile ilişkili olabileceği ileri sürülmektedir. Ancak bu virusların direkt olarak gastroenterite neden olup olmadıkları ve hastalıktaki rolleri ile ilgili yeterince veri mevcut değildir. Bu çalışmada, ishalli çocukların dışkı örnekle-rinde rotavirus, norovirus, sapovirus, astrovirus, Aichi virus, parechovirus ve enterovirus varlığının terstranskriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmaya, Haziran-Aralık 2012 tarihleri arasında ishal şikayeti ile hastanemize başvuran, rutin bakteriyolojik ve parazitolojik incelemelerinde patojen etken saptanmayan, 5 yaş altındaki 50 çocuk olguya ait dışkı örneği dahil edilmiştir. Örneklerden RNA ekstraksiyonu yapıldıktan sonra, ters transkripsiyon ile elde edilen cDNA'larla öncelikle internal kontrol (İK) ekspresyon analizleri gerçekleştirilmiş ve 31 örnekte (%62) İK pozitif olarak bulunmuştur. Bu örneklere daha sonra rotavirus grup A ve C, norovirus (NoV) genogrup GI ve GII, sapovirus, astrovirus, Aichi virus, parechovirus ve enterovirus için özgül primer çiftleri kullanılarak PCR yöntemi uygulanmıştır. Öngörülen büyüklükte elde edilen PCR ürünleri, pBSK vektörüne klonlandıktan sonra dizi analizleri yapılmış ve BLAST programı kullanılarak GenBank veritabanında bulunan ilgili virusların genomlarıyla karşılaştırılarak viruslar tanımlanmıştır. Çalışmada, İK pozitif 31 örneğin 12 (%38.7)'sinde pozitiflik tespit edilmiş; bu örneklerin 6 (%19.3)'sında NoV GII, 2 (%6.5)'sinde NoV GI, 2 (%6.5)'sinde rotavirus grup A, 1 (%3.2)'inde astrovirus ve 1 (%3.2)'inde sapovirus RNA'larının varlığı belirlenmiştir. Çalışılan toplam örnek sayısı dikkate alındığında; en sık rastlanılan etkenin noroviruslar (8/50, %16) olduğu, Geliş Tarihi

show abstract

Section: Pcr Yöntemiunclassified

Section: Tanımlanan Virusların Toplam öRnek Sayısına Oranı* (N= 50)unclassified

Section: Introductionunclassified

See 2 more Smart Citations

Investigation of Seven Different RNA Viruses Associated with Gastroenteritis in Children Under Five Years Old

Akhter¹,

Turegun²,

Kıyan³

et al. 2014

Mikrobiyol Bul

View full text Add to dashboard Cite

show abstract

“…The infections typically occur sporadically, and the cause of 2 to 10% of total viral gastroenteritis cases is attributed to HAstVs (1)(2)(3)(4)(5)(6). Astroviruses (AstVs) possess nonenveloped, icosahedrally shaped virions containing approximately 6,800 nucleotides (nt) of single-stranded positive-sense RNA (7).…”

mentioning

confidence: 99%

Wastewater Analysis Indicates that Genetically Diverse Astroviruses, Including Strains Belonging to Novel Clades MLB and VA, Are Circulating within Japanese Populations

Hata

Katayama

Kitajima

et al. 2015

Appl Environ Microbiol

View full text Add to dashboard Cite

Human astroviruses (HAstVs) are a common etiological agent of infantile gastroenteritis. Recent studies revealed that novel astrovirus (AstV) strains of the MLB clade (MLB-AstVs) and VA clade (VA-AstVs), which are genetically distinct from the classic HAstVs, are circulating in the human population. In the present study, we quantified classic HAstVs as well as carried out a genetic analysis of classic and novel HAstVs in wastewater in Japan. The concentration of classic HAstVs in the influent water samples ranged from 10 4 to 10 5 copies per liter, and the amount removed by wastewater treatment was determined to be 2.4 ؎ 0.3 log 10 . Four types of classic HAstV strains (HAstV types 1, 2, 5, and 4/8) as well as novel AstV strains belonging to the MLB-2, VA-1, and VA-2 clades were identified using reverse transcription-PCR (RT-PCR) assays, including assays newly developed for the detection of strains of the MLB and VA clades, followed by cloning and nucleotide sequencing. Our results suggest that genetically diverse AstV strains are circulating among the human population in Japan. The newly developed (semi)nested RT-PCR assays for these novel AstV clades are useful to identify and characterize the novel AstVs in environmental waters.H uman astroviruses (HAstVs) are considered one of the most important causes of infantile gastroenteritis worldwide (1). The infections typically occur sporadically, and the cause of 2 to 10% of total viral gastroenteritis cases is attributed to HAstVs (1-6). Astroviruses (AstVs) possess nonenveloped, icosahedrally shaped virions containing approximately 6,800 nucleotides (nt) of single-stranded positive-sense RNA (7). It has been reported that the diameter of AstV particles shed in fecal specimens ranges from 28 to 31 nm, while the diameter of those grown in cell culture is 41 nm (8). Their viral genome consists of three open reading frames (ORFs), namely, ORF1a, ORF1b, and ORF2, encoding the serine protease, RNA-dependent RNA polymerase, and capsid proteins, respectively (7). HAstVs are antigenically or genetically classified into eight different types (HAstV type 1 [HAstV-1] to HAstV-8). Previous studies revealed that HAstV-1 is the most prevalent type among infected individuals and in the environment, followed by 5,[9][10][11][12][13].Because HAstV can be excreted in the feces of infected individuals at a high concentration (up to 10 15 particles/g) (14), examination of municipal wastewater samples could be an effective approach to understand the actual prevalence and epidemiology of these viruses (15, 16). In spite of their importance as enteric pathogens, the occurrence and other characteristics of HAstVs in water compared to those of other enteric viruses, such as noroviruses, rotaviruses, and adenoviruses, have not been well documented (17, 18). Due to the scarcity of knowledge, the fate of HAstVs in water environments and wastewater treatment processes is not well understood.Recent studies based on viral metagenomic analysis have identified some novel AstVs, namely, clade MLB ...

show abstract

Enhanced enteric virus detection in sporadic gastroenteritis using a multi-target real-time PCR panel: A one-year study

2013

View full text Add to dashboard Cite

Viral gastroenteritis causes significant mortality and morbidity worldwide. Identifying the etiology of viral gastroenteritis is a challenge as most enteric viruses (EVs) are non-culturable. This study is to develop an EV testing panel using real-time PCR (EVPrtPCR) to simultaneously detect rotavirus, norovirus, sapovirus, astrovirus, and enteric adenovirus in stool samples. EVPrtPCR using universal amplification conditions was run in a single instrument run. EVPrtPCR was used to test 2,486 sporadic gastroenteritis samples submitted for EV testing using electron microscopy (EM) between July 2008 and July 2009. Retesting spiked negative stool samples and Salmon DNA as internal control were used to evaluate inhibition. EVPrtPCR detected viruses in significantly more samples: 748 (34%) as compared to 94 (3.8%) by EM. EM did not detect any norovirus, sapovirus, and mixed infection, and detected only 39% of rotavirus and 38.2% of enteric adenovirus positive samples. Four samples that tested positive for rotavirus and two for adenovirus and for small-round-structured viruses by EM were negative by EVPrtPCR. Norovirus was the most common virus detected (17.6%) with 92.4% as genogroup II, followed by rotavirus (6.8%), sapovirus (4.2%), astrovirus (2.0%), and enteric adenovirus (1.4%) with 9% samples positive for mixed infection. Overall, EV identification followed a U-shaped age distribution; positive samples were more common in children ≤5 years old and adults >60 years old. Norovirus, sapovirus and astrovirus showed winter predominance and rotavirus peaked in the spring. No inhibition was observed. Molecular technology significantly enhanced the identification of EV causing sporadic gastroenteritis in Alberta.

show abstract

A single-tube multiplex PCR for rapid detection in feces of 10 viruses causing diarrhea

Cited by 80 publications

References 14 publications

Investigation of Seven Different RNA Viruses Associated with Gastroenteritis in Children Under Five Years Old

Investigation of Seven Different RNA Viruses Associated with Gastroenteritis in Children Under Five Years Old

Wastewater Analysis Indicates that Genetically Diverse Astroviruses, Including Strains Belonging to Novel Clades MLB and VA, Are Circulating within Japanese Populations

Enhanced enteric virus detection in sporadic gastroenteritis using a multi-target real-time PCR panel: A one-year study

Contact Info

Product

Resources

About