A Polymerase Chain Reaction Protocol for the Detection of Clavibacter xyli subsp. xyli, the Causal Bacterium of Sugarcane Ratoon Stunting Disease

Abstract

A polymerase chain reaction (PCR) protocol was developed that specifically detected Clavibacter xyli subsp. xyli, the causal agent of sugarcane ratoon stunting disease. Generic PCR products from the intergenic transcribed spacer (ITS) region of 16S-23S ribosomal DNA of C. xyli subsp. xyli and C. xyli subsp. cynodontis were cloned and sequenced. Based on a multiple sequence alignment among these two sequences and other nonredundant highly homologous sequences from the database, two C. xyli subsp. xyli-specific PCR primers were designed, Cxx1 (5′ CCGAAGTGAGCAGATTGACC) and Cxx2 (5′ ACCCTGTGTTGTTTTCAACG). These two 20-mer oligonucleotides primed the specific amplification of a 438-bp DNA product from genomic DNA samples of 21 C. xyli subsp. xyli strains. Amplification was not observed with genomic DNA of one C. xyli subsp. cynodontis strain, five strains of four other Clavibacter species, and two strains of two Rathayibacter species. The 438-bp PCR product also was amplified directly from cultured C. xyli subsp. xyli cells and from C. xyli subsp. xyli-infected sugarcane vascular sap with a unique reaction buffer containing polyvinylpyrrolidone and ficoll. Extraction of genomic DNA was not necessary prior to PCR assay.

Incidência de Leifsonia xyli subsp. xyli em áreas de multiplicação de cana-de-açúcar no Espírito Santo, sul da Bahia e oeste de Minas Gerais

“…Pelo fato da doença não apresentar sintomas aparentes, os produtores não percebem a necessidade de controle do raquitismo (22). O diagnóstico do raquitismo requer a detecção da bactéria causadora da doença em amostras de seiva do xilema, extraídas de internódios basais de colmos amostrados no campo, utilizando-se para isso técnicas sorológicas (2, 3, 13, 15, 17) ou análise de PCR (19). A técnica sorológica de Dot Blot EIA (Dot Blot Enzyme Immunoassay ou simplesmente Dot Blot) embora seja menos sensível que a baseada na amplificação do DNA, é, ainda, largamente empregada, pois o soro bruto é bastante específico contra Lxx (3), sendo uma técnica relativamente barata e adequada para levantamentos de campo, onde se busca detectar níveis mais elevados de colonização dos colmos, com acima de 2.10 6 u.f.c./mL (3, 17).…”

Recent advances in the molecular biology ofLeifsonia xylisubsp.xyli, causal organism of ratoon stunting disease

“…The identification of L. xyli subsp. xyli as the causal agent of RSD (Davis et al 1980) greatly facilitated the development of serological (Davis and Dean 1984;Croft et al 1994) and DNA-based diagnostic tests (Chung et al 1994;Pan et al 1998;Fegan et al 1998;Taylor et al 2003) (Fig. 2).…”

“…Chung et al (1994) used cloned DNA from L. xyli subsp. xyli as probes in Southern and dot blot hybridisations while Pan et al (1998) and Fegan et al (1998) both used the intergenic transcribed spacer regions of the 16S-23S rRNA genes to develop diagnostic primers for polymerase chain reaction (PCR)-based assays. Taylor et al (2003) also used a PCR technique but developed L. xyli subsp.…”

Análise do proteoma e do sistema antioxidante de cana-de-açúcar em resposta à colonização por Leifsonia xyli subsp. xyli, agente causal do raquitismo-das-soqueiras

“…O sintoma mais evidente do raquitismo, como o nome implica, é um subdesenvolvimento da planta, caracterizado pela redução de seu porte e pelo encurtamento dos entrenós. Internamente, os sintomas se caracterizam pela presença de pontuações avermelhadas abaixo dos nós e coloração rosada próximo ao meristema apical de plantas jovens (STEINDL, 1961;PAN et al, 1998). No entanto, estes sintomas não são típicos, podendo ser facilmente confundidos com doenças provocadas por outros patógenos vasculares, além de serem influenciáveis por condições ambientais (TOKESHI, 1980).…”

“…No entanto, estas técnicas não possuem a sensibilidade necessária para detectar o patógeno quando presente em baixo título em tecidos vegetais (LÓPEZ et al, 2009). Desta forma, a reação de PCR convencional usando primers específicos tem sido o método mais sensível usado na detecção de Lxx (FEGAN et al, 1998;PAN et al, 1998;GAO et al, 2008). Porém, esta técnica não fornece uma estimativa precisa da quantidade de bactéria presente no material analisado, além de necessitar de procedimentos extras, como visualização dos amplicons em gel de agarose.…”