A novel, sensitive, and specific RT‐PCR technique for quantitation of hepatitis C virus replication

Abstract

The detection of negative-strand hepatitis C virus (HCV) RNA is a hallmark of replication. A highly sensitive and specific method is required to quantify the very low level of replication inherent to in vitro infection systems. Based on reverse transcription with a tagged primer in the 5' non-coding region of the HCV genome, followed by a nested PCR with a second round of real-time PCR, a novel method is described with improved sensitivity for negative-strand HCV RNA quantification. The lower detection level was 25 copies per reaction of negative-strand HCV RNA, even in the presence of 1 x 10(5) copies of positive-strand HCV RNA. This protocol was applied to the detection of negative HCV strand RNA in the liver of HCV-infected patients as well as in primary human hepatocytes infected in vitro. In both models, and particularly in each of three, independent in vitro infection experiments, this assay permitted the quantitation of HCV replication.

Quantitation of replication of the HCV genome in human livers with end‐stage cirrhosis by strand‐specific real‐time RT‐PCR assays: Methods and clinical relevance

“…PS and NS varied widely from liver to liver, but the virus (both PS and NS) was distributed quite uniformly throughout the livers with cirrhosis. NS correlated with PS concentrations, with PS/NS ratios ranging from 3 to 340, comparable with data from two recent studies of a limited number of patients with chronic hepatitis C with methods using amplification of the 5 0 -UTR [Yuki et al, 2006;Carriere et al, 2007]. The PS/NS correlation suggests that HCV, like other Flaviviridae adopts an asymmetric and semi-conservative replication [Chu and Westaway, 1985;Gong et al, 1996;Pawlotsky et al, 2007].…”

Highly Sensitive Methods Based on Seminested Real-Time Reverse Transcription-PCR for Quantitation of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Unspliced and Multiply Spliced RNA and Proviral DNA

“…In addition, it requires labor-intensive and time-consuming experimental procedures. In contrast, quantitative nested real-time PCR, an approach recently developed for detection and quantitation of several pathogens and tumor markers (3,12,16,17,22), allows increasing the assay sensitivity dramatically without losing the quantitative factor. Here we report the development of highly sensitive seminested real-time RT-PCR methods for the detection and quantitation of HIV-1 RNA and DNA in PBMC samples from patients under HAART, with a detection limit of four copies per reaction and a linear range of 6 orders of magnitude.…”

Determinazione quantitativa di HCV-RNA: valutazione comparativa dei saggi Abbott Real-Time e Versant bDNA v.3

“…Numerose metodologie che si avvalgono delle più moderne tecniche biomolecolari sono state nel corso degli anni sviluppate da diversi gruppi di ricerca nazionali e internazionali e dalle industrie produttrici di sistemi diagnostici e rese disponibili per lo studio della dinamica dell'infezione e la valutazione della cinetica di risposta virologica alla terapia (1, 2, 4, 5, 10, 13, 15, 23, 26): l'affinamento di tali tecniche ed una maggiore affidabilità in termini di precisione e riproducibilità dei risultati quantitativi permettono oggi una gestione migliore del paziente ed un monitoraggio delle terapie tali da consentire di ridurre i tempi di trattamento necessari per l'eradicazione dell'infezione, ovvero di decidere sulla sospensione della terapia qualora vi siano evidenze dell'inefficacia della stessa. L'introduzione delle metodiche di real-time PCR hanno in questo ambito fornito un grosso contributo: esse infatti sono in grado di garantire indubbi vantaggi rispetto alle metodiche convenzionali di amplificazione, quali una più corretta valutazione quantitativa sia per valori minimi che per valori molto elevati di carica virale, garantita dall'esteso range dinamico di amplificazione; una sensibilità e specificità migliorate rispetto alle tecniche di amplificazione convenzionale; una riduzione della complessità analitica e soprattutto dei tempi di esecuzione e refertazione; la possibilità di poter automatizzare tutte le fasi analitiche, dall'estrazione degli acidi nucleici fino alla rilevazione dei risultati, senza problemi di contaminazione, in quanto le piattaforme sono completamente chiuse e consentono di processare contemporaneamente un numero consistente di campioni senza dover intervenire manualmente nel passaggio da una fase all'altra della lavorazione (3,4,5,10,16,22,23). Il dosaggio Abbott Real-Time HCV-RNA si avvale della più moderna tecnologia di amplificazione e quantificazione e sfrutta le potenzialità della purificazione dell'RNA mediante estrazione automatica da diverse matrici biologiche (sangue, siero, plasma).…”