A Fluorogenic Aryl Fluorosulfate for Intraorganellar Transthyretin Imaging in Living Cells and in Caenorhabditis elegans

Abstract

Fluorogenic probes, due to their often greater spatial and temporal sensitivity in comparison to permanently fluorescent small molecules, represent powerful tools to study protein localization and function in the context of living systems. Herein, we report fluorogenic probe 4, a 1,3,4-oxadiazole designed to bind selectively to transthyretin (TTR). Probe 4 comprises a fluorosulfate group not previously used in an environment-sensitive fluorophore. The fluorosulfate functional group does not react covalently with TTR on the timescale required for cellular imaging, but does red shift the emission maximum of probe 4 in comparison to its non-fluorosulfated analog. We demonstrate that probe 4 is dark in aqueous buffers, whereas the TTR•4 complex exhibits a fluorescence emission maximum at 481 nm. The addition of probe 4 to living HEK293T cells allows efficient binding to and imaging of exogenous TTR within intracellular organelles, including the mitochondria and the endoplasmic reticulum. Furthermore, live Caenorhabditis elegans expressing human TTR transgenically and treated with probe 4 display TTR•4 fluorescence in macrophage-like coelomocytes. An analog of fluorosulfate probe 4 does react selectively with TTR without labeling the remainder of the cellular proteome. Studies on this analog suggest that certain aryl fluorosulfates, due to their cell and organelle permeability and activatable reactivity, could be considered for the development of protein-selective covalent probes.

Stilbene Boronic Acids Form a Covalent Bond with Human Transthyretin and Inhibit Its Aggregation

“…19,27,32,60–63 Although a consensus explanation is not apparent, the polarity of pendant functional groups can play a role in ligand orientation. 56,64 In our stilbenes, however, the relevant log P values of phenol (1.46), benzoic acid (1.87), and phenylboronic acid (1.59) are similar, 65 suggesting that hydrophilicity alone contributes little to their orientation in the T 4 -binding site.…”

Nanoscale gizmos – the novel fluorescent probes for monitoring protein activity

“…In this scenario, an environment sensitive fluorogenic probe, 1,3,4-oxadiazole has been designed to bind selectively to transthyretin (TTR). Addition of this fluorogenic probe to HEK293T cells allowed efficient binding and imaging of cellular organelles like mitochondria and endoplasmic reticulum, making it a new fluorescent tool for living cells [23]. Upon application of this fluorogenic probe in Caenorhabditis elegans, it successfully detected TTR in six macrophage like cells.…”

Arylfluorsulfat‐basierte Elektrophile für die kovalente Proteinmarkierung

“…Seither wurde die Entwicklung von Substanzen mit Sulfonylfluoridmotiv, die irreversibel an Proteine binden, stetig vorangetrieben, wobei deren relativ geringe Reaktivität für die selektive kovalente Inhibition verschiedener Proteine genutzt wurde . Obwohl Arylfluorsulfate 1930 erstmals in der Literatur beschrieben wurden, verhinderte das Fehlen einer robusten Synthesemethode bis auf wenige Ausnahmen, dass die Verwendung dieser funktionellen Gruppe in Erwägung gezogen wurde, bis sie 2015 durch Kelly und Mitarbeiter erstmals als elektrophiler Gefechtskopf für kovalente Proteinmodifikationen eingesetzt wurde . Das Wiederaufleben von Arylfluorsulfaten wurde besonders durch die Gruppe um Sharpless vorangetrieben, was der Entwicklung einer einfachen Synthesemethode dieser Stoffe zu verdanken ist (Schema b) .…”

“…Beim ersten dokumentierten Versuch, Fluorsulfate zum Zwecke kovalenter Proteinmodifikationen einzusetzen, ersetzten Kelly und Mitarbeiter das Sulfonylfluorid‐basierte Elektrophil zuvor beschriebener fluorogener Transthyretin(TTR)‐Sonden durch eine ArOSO 2 F‐Gruppe (Schema a) . Im Unterschied zu den Sulfonylfluorid‐tragenden Sonden 1 und 2 reagierten die Arylfluorsulfat‐Verbindungen 3 und 4 langsam mit der p K a ‐verschobenen Lys15‐ϵ‐Aminogruppe des Transthyretins und erzielten aufgrund der geringeren Reaktivität keinen quantitativen Umsatz.…”

“…Aufgrund ihrer geringeren Reaktivität zeichnen sich Arylfluorsulfatsonden durch selektivere kovalente Proteinmarkierung aus als Arylsulfonylfluoride, welche sich bereits intensiver Verwendung für Experimente am gesamten menschlichen Proteom erfreuen . Die Arbeitsgruppen um Kelly und Sharpless verglichen die Reaktivität der beiden funktionellen Gruppen und konnten zeigen, dass die Sonden 9 und 11 (Schema a), welche das strukturell einfachere Arylfluorsulfat tragen, lediglich eine geringe Zahl an Proteinen in HeLa‐Zellkulturen und ‐Lysaten kovalent modifizierten, wohingegen die analoge Sulfonylfluoridsonde 10 (Schema a) unter identischen Bedingungen ein breites Spektrum an Proteinen markierte …”