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The system previously described for inducing single gene mutations in Chinese hamster cells has been extended to produce additional auxotrophic mutants. An improved method for quantitating the efficiency of single gene mutation to specific auxotrophies has been developed. Mutagenesis in the forward direction has been measured after treatment of these cells with ethyl methanesulfonate, N-methyl-"-nitro-N-nitrosoguanidine, hydroxylamine, a n acridine mustard , caffeine and ultraviolet-and X-irradiation. For each agent, the single cell survival curve and the efficiency of chromatid breakage and rearrangement were measured. Similar measurements were also carried out with a water-soluble carcinogen N-nitrosomethylurea, which was shown to be effective in producing auxotrophic, somatic mutations. These results offer promise of illuminating the relationships between cell killing, chromosomal aberration, single gene mutations and carcinogenesis produced by various agents. The methods described can be used in routine testing of drugs, food additives, and environmental pollutants for mutagenic action in mammalian cells in vitro.In preceding papers of this series, a system was described in which mutations to nutritional deficiency could be produced in Chinese hamster cells grown in vitro, and the corresponding clones isolated. The mutations so obtained are single-step; they have reversion frequencies in the neighborhood of to lo-* so that experiments with high resolving power are possible; the deficient mutants so far described are "nonleaky," i.e., they display no growth whatever in the absence of the required nutrilite, so permitting easy scoring of mutagenesis; and the chromosomal constitution of the original cell and its various mutants is satisfactorily constant with a near-diploid number. Mutagenesis by ethyl methanesulfonate (EMS) and N-methyl-"nitro-N nitrosoguanidine (MNNG) was described, which produced mutants with growth requirements for glycine (gly-) or inositol (ino-) and mutants requiring a combination of glycine, hypoxanthine, and thymidine (gly-+ hyp-+ thy-). Reverse mutants to prototrophy from proline-requiring forms were also produced with EMS and MNNG. Some quantitative data were presented for both forward and reverse mutation frequencies at various loci produced by the mutagens employed (Kao and Puck, J. CELL. PHYSIOL., 74: 245-258 '68). Chu and Malling ('68) confirmed the production of mutations by these chemical agents in Chinese hamster cells using other genetic markers.In the present paper the production of additional auxotrophic mutations is described; a larger variety of chemical mutagens is examined; and the action of X-and ultraviolet (UV) radiation is studied. These agents are compared quantitatively with each other for their effectiveness in producing forward mutations, cell killing, and chromosomal aberrations in Chinese hamster cells in vitro. In addition a beginning has been made in extending such studies to carcinogenic agents. MATERIALS AND METHODS(1) Cell culture. The previously d...
EinleitungBei Proteus ist die Anzahl der Publikationeri iiber Mutationsausloisung durch UV recht gering. Versuche von HUTCHINSON und MEDILL (1954), biochemische Mutanten zu erhalten, waren erfolglos. Auch LEDERBERG (1948) macht gleiche Angaben iiber unveroffentlichte Ergebnisse von BEAM und TATUM. Bei eigenen Bestrahlungsversuchen wurde eine Penicillin-Wasser-Behandlung eingefiihrt (MATES u. BOHME 1960). Hierbei wurden zwar einige Mangelmutanten isoliert ; jedoch konnte nicht eindeutig nachgewiesen werden, dalj es sich tatsiichlich um UV-induzierte Mutanten handelt. Diese Erfahrungen lieBen es wiinschenswert erscheinen, die Wirkung der UV-Strahlen auf Proteus niihermit der gleichen Methodik wie bei Escheria coli (DEMEREC 1950) -zu untersuchen. Das hier angewandte Selektionsverfahren beruht auf dem Nachweis des Mutationsschrittes von der Abhangigkeit zur Unabhiingigkeit gegenuber Streptomycin2).Zunachst wurde der EinfluB von UV-Strahlen bei einigen str-abhangigen Mutanten sowie bei einem Wildtypstamm von Protezcs ermittelt. Um zu kliiren, ob nach UV-Einwirkung auf str-abhiingige Bakterien str-unabhangige Mutanten (Revertanten) nachgewiesen werden konnen, wurden die Bakterien vor und nach der Bestrahlung niit, verschieden hoher Dosis unter verschiedenen Bedingungen kultiviert. Material und MethodikRtLm me. Fur die Untersuchungen wurden aus Stamm VI isolierte str-abhlngige Mutanten, die StLmme str-d-3, 7, 9, 10, 12, 15, 16, 17, 45 sowie 48 (BOHME 1961a) und aul3erdem Mutantenstamme eines anderen Ausgangsstammes (167), die str-abhangigen StLmme str-d-l67/10, 9, 8, 7 verwendet. Die Stiimme wurden nach dem Nomenklnturvorschlag von DEMEREC (1956) bezeichnet.K u l t u r b e d i n g u n g e n , Die verschiedenen Kultur-und Versuchsbedingungen werden an den entsprechcnden Stellen im Text wiedergegeben. Nachstehend wird nur die allgemeine Methodik bis znr erfolgten Bestrahlung besprochen. Die Nahrlosung setzte sich zusamnien am: lo& gemiirserten Briihwiirfeln (VEB ,,Suppina", Nahrungsmittelwerke l ) Dr. MARGOT MATES, Wernigerode/Harz, Maxim-Gorki-Str. 4 a 2) Streptomycin im folgendpn abgekurzt str UV-induzierte Mutationen bei Proteus mirabilis 23Auerbach/Vogtland, mit einem durchschnittlichen Kochsalzgehalt von 55%). 1% Pepton, 0,5% Kochsalz, pH 6,9 bis 7.0. Fur Plattenkulturen erhielt diese Nahrlosung einen Agar-Zusatz von 2-2,5y0 Den Niihrmedien der str-abhiingigen Stlmme wurden 50 y Streptomycin-Sulfat pro ml Niihrlosung bzw. 30 y pro ml Niihragar zugesetzt (optimale Mengen). Werden str-freie Niihragarplatten beimpft'), so uberlebt ausschlieBlich der gesuchte Reversionstyp, alle ubrigen (nur in Anwesenheit von Streptomycin wachstumsfahigen) Zellen stellen dagegen das Wachstum ein und autolysieren. Die Versuchskulturen wurden nach 14stundiger Bebrutung in der Schuttelmaschine bei 37 "C zur Entfernung des Streptomycins in physiologischer Kochsalzlosung gewaschen und in SORENSEN-Puffer resuspendiert .B e s t r a h l u n g . Zur Bestrahlung diente eine Hg-Niederdruck-Quarzlampe ,,Solimed" der Firma BR. HOPFEL, Leipzig-Markl...
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