Microcolony detection in thin layer culture as an alternative method for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples

Abstract

Tuberculosis remains one of the major causes of mortality worldwide. The early detection of new cases is an important goal in the program of tuberculosis control. Several methodologies for rapid and accurate laboratorial diagnosis have been developed, however, some of these techniques are expensive or cumbersome, making their implementation in low-income regions unfeasible. In this study, the thin layer culture method was compared with conventional culture method and it was observed that it provides earlier results and a presumptive species identification, being adequate alternative method for rapid laboratory diagnosis. The diagnosis is an important tool for TB control because it allows establishing the correct treatment and the required further control practices to break down the transmission chain of the bacilli. Conventional laboratorial methods for diagnosis of TB are sputum microscopy and culture in Lowenstein-Jensen or Ogawa medium (2,3). However, these methodologies present low sensitivity or take a long time to achieve results. Even though there are several new methodologies with higher specificity and/ or sensitivity able to provide earlier results than the conventional methodologies, the implementation of these alternative methods in the routine of the majority of the laboratories around the world is very difficult because of their high cost and complexity (4-6).The development of new, inexpensive, and more sensitive methodologies for TB diagnosis able to provide earlier results than the conventional methods is a priority for TB control.

Evaluation of fetal bovine serum as a source of enrichment in synthetic culture medium for the isolation of Mycobacterium bovis

“…A utilização do Middlebrook 7H11 modificado em camada delgada para visualização precoce de micobactérias já foi realizada em outros estudos (Dib et al, 2006;Marcondes et al, 2006;Mejia et al, 1999;Robledo et al, 2006;Rosário et al, 2014;Silva et al, 2007). O tempo médio para detecção macroscópica das micobactérias em camada delgada, variou entre 12 e 25 dias pós-semeadura, resultado inferior ao normalmente obtido nos meios tradicionais à base de ovos, que podem demorar entre dez a doze semanas (OIE, 2022).…”

“…O meio de Middlebrook 7H11 enriquecido com suplemento OADC (ácido oléico, albumina, dextrose e catalase), permite o isolamento precoce reduzindo o tempo de incubação para três semanas ou menos (Issa et al, 2017). Além disso, permite a visualização das microcolônias (colônias microscópicas) em estágios iniciais e a identificação preliminar baseada nas características morfológicas, quando utilizado em camada delgada (Dib et al, 2006;Marcondes et al, 2006;Mejia et al, 1999;Robledo et al, 2006;Rosário et al, 2014;Silva et al, 2007). No entanto, a baixa qualidade dos suplementos OADC comerciais disponíveis podem inibir o crescimento ideal dos bacilos (Issa et al, 2017), além das dificuldades inerentes a variação das taxas de dólar, e longos períodos necessários para importação, que reduzem as taxas de validade para sua utilização (Sabagh et al, 2012).…”

Thin layer microcolony culture associated with PCR for early identification of Mycobacterium bovis

“…Organs were decontaminated by Petroff’s classic method ( Kantor, 1988 ), and cultured in duplicate in both media to avoid losses by sample contamination. Cultures were incubated at 37 °C, and thin layer plates were placed in a CO 2 atmosphere ( Dib et al , 2006 ; Marcondes et al , 2006 ; Mejía et al , 1999 ; Robledo et al , 2006 ; Silva et al , 2007 ).…”

“…In an attempt to perfect traditional microbiological methods, researchers have investigated the efficiency of clear media in thin layer culture, such as Middlebrook 7H11. These media enable the visualization of initial growth stages microcolonies and preliminary identification of mycobacteria by morphological characteristics of the colonies ( Dib et al , 2006 ; Marcondes et al , 2006 ; Mejía et al , 1999 ; Robledo et al , 2006 ; Silva et al , 2007 ).…”

Associação da técnica de cultivo em camada delgada contendo ágar Middlebrook 7H11 Modificado com a Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) para identificação precoce de Mycobacterium bovis em órgãos de bovinos e bubalinos oriundos de abatedouros comerciais

“…Figura 12 -Reação de PCR para amplificação do DNA de micobactérias isoladas em meio de Middlebrook 7H11 modificado em camada delgada, evidenciando bandas de aproximadamente 500 pb. M) marcador de peso molecular de 100 pb, 1) Amostra 12-1, 2) Amostra 12-2, 3) Amostra 16-1, 4) Amostra 16-2, 5) Amostra 32-1, 6) Amostra 32-2, 7) Amostra 34-1, 8) Amostra 34-2, 9) Amostra 36-1, 10) Amostra 36-2, 11) Controle Negativo água ultra-pura, (MEJIA et al, 1999;ROBLEDO et al, 2006;SILVA et al, 2007 (VITALE et al, 1998;SAKAMOTO et al, 1999). Consiste na identificação e amplificação in vitro de uma seqüência-alvo de DNA (segmentos de genes) por meio de uma reação em cadeia da enzima taq-polimerase, permitindo o estudo da expressão gênica e o diagnóstico de doenças infecciosas em poucos dias ou até horas (ANDRADE, 1993;RUGGIERO et al, 2007).…”