Hepes na produção de embriões bovinos in vitro

Abstract

O objetivo do presente estudo foi de avaliar a amplitude da variação de pH em meios de maturação e de cultivo embrionário, com diferentes concentrações do tampão HEPES. Inicialmente, foi determinado o efeito de diferentes concentrações de HEPES (0, 12,5 e 25,0mM) na variação do pH dos meios de maturação (TCM-199 modificado) e desenvolvimento embrionário (KSOM modificado) em meio ambiente, à temperatura de 25ºC, e na estufa, em uma atmosfera de 5% de CO2 em ar a 39ºC. Em um segundo experimento, os oócitos foram maturados em TCM-199 modificado sem HEPES (142 oócitos) ou com 25,0mM de HEPES (137 oócitos) e foi avaliado índice de blastocisto. O meio Fert-TALP foi utilizado para a fecundação, sendo que os embriões foram co-cultivados com células epiteliais de oviduto (CEO) em KSOM modificado com 10% de SFB. Um terceiro experimento foi delineado para determinar a importância da presença do HEPES no meio de cultivo embrionário sobre o desenvolvimento de embriões bovinos in vitro. Para isso, após a retirada do cumulus, os zigotos foram divididos ao acaso e co-cultivados com CEO em KSOM modificado (com 10% de SFB) sem HEPES (grupo controle; n = 95) ou com 25,0mM de HEPES (grupo HEPES; n = 92). Foram mantidos em cultivo somente os embriões com duas ou mais células, sendo considerados desenvolvidos os que atingiram o estádio de blastocisto expandido (Bx), 7 e 9 dias após inseminação. O cultivo dos oócitos e embriões, em ambos os experimentos, foi efetuado em estufa a 39ºC, com uma atmosfera contendo 5% de CO2 e umidade saturada. Os resultados mostram que os meios contendo 25,0mM de HEPES foram mais eficientes em minimizar a variação do pH que os meios com 12,5mM ou sem HEPES. Além disso, a adição de HEPES ao meio de maturação aumentou os índices de Bl sobre o total de oócitos e sobre o total de clivados (21,9% e 42,86%) com relação ao controle (10,56 e 16,67%; p<0,05). Na determinação da importância do HEPES no desenvolvimento embrionário, o grupo HEPES apresentou índices superiores de Bx (45,65%) em relação ao controle (11,58%; p<0,01). A uniformidade dos resultados foi um dos aspectos positivos observados quando o HEPES estava presente no meio de cultivo embrionário. Portanto, o uso do HEPES, durante a maturação e o cultivo embrionário, é recomendável para o aumento da produção de embriões in vitro com maior repetibilidade.

Transporte de oócitos bovinos em meio de maturação sem controle de atmosfera gasosa

“…O transporte durante 18h, apesar de não ter afetado a taxa de clivagem e a eclosão dos embriões que chegaram ao estágio de blastocisto, resultou em diminuição no número de blastocistos produzidos. Apesar de muitos trabalhos comprovarem a eficiencia do Hepes como tamponante do pH (TWAGIRAMUNGU et al 1998;FRY et al, 2000;MONTAGNER et al, 2000), observou-se uma redução da viabilidade no grupo T18 que pode ter ocorrido pela incapacidade do tampão HEPES em manter o pH durante 18h, que pode ter determinado prejuízos no desenvolvimento posterior dos embriões. Entretanto, esta análise não foi realizada no presente estudo, sendo necessárias novas investigações que avaliem diferentes sistemas para o transporte, a troca ou reposição do meio após o período de 12h.…”

“…Com relação à atmosfera gasosa, o CO 2 é utilizado para controlar o pH dos meios tamponados com bicarbonato (BOONE & SHAPIRO, 1990). O HEPES vem sendo muito utilizado como tampão para evitar grandes variações de pH nos meios de maturação e cultivo embrionário (TWAGIRAMUNGU et al 1998;FRY et al, 2000;MONTAGNER et al, 2000), além de ser o mais utilizado para remessa de oócitos coletados e destinados à PIV.…”