Integração de pAN7-1 no genoma de Magnaporthe grisea mediada por enzima de restrição

Abstract

Visando explorar a mutagênese insercional em Magnaporthe grisea, foram avaliadas a transformação dos protoplastos obtidos após adequação do protocolo e a eficiência da integração de pAN7-1 no genoma do ascomiceto na presença da enzima de restrição Hind III. Os protoplastos de M. grisea I-22 foram prontamente transformados para a resistência à higromicina. Quando o vetor linearizado com Hind III foi usado para transformar o fungo na presença de Hind III, a eficiência de transformação foi 1,1 a 8,1 vezes superior ao tratamento sem a adição da enzima. No geral, a melhor concentração de Hind III foi 5 unidades/reação de transformação. Tal concentração promoveu a produção média de 332 transformantes/µg de pAN7-1/10(7) protoplastos. A presença do gene de seleção hph no genoma de 18 indivíduos resistentes à higromicina foi confirmada por PCR.

Padrão de integração de pAN7-1 em mutantes de Magnaporthe grisea com patogenicidade alterada em arroz

“…Enquanto os mutantes T93 e T251 foram obtidos por meio de integração de pAN7-1 mediada por 50 U e 30 U de HindIII, respectivamente, T108 foi gerado por transformação convencional (integração não mediada por enzima de restrição), utilizando o vetor linearizado. Por sua vez, a mutação insercional em T41 foi gerada sem a adição de HindIII à reação de transformação, porém, foi favorecida pela atividade residual da enzima utilizada para a linearização do vetor (11,12). O isolado selvagem I-22, patogênico a plantas de arroz, cedido pelo Laboratório de Fitopatologia Molecular da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, foi utilizado como controle.…”

“…O padrão de integração do vetor nos mutantes REMI, caracterizado pelo baixo número de cópias no genoma e a aleatoriedade dos eventos de inserção, aliado à eficiência de transformação obtida por Marchi et al (11), indicaram o potencial de REMI para a mutagênese insercional de M. grisea quando conduzida com pAN7-1 e HindIII. Programas de mutagênese REMI, conduzidos com as características supracitadas, constituem ferramenta importante para a prospecção dos genes de M. grisea envolvidos na patogenicidade em arroz, cuja compreensão é fundamental para o estabelecimento de estratégias eficientes de manejo da doença.…”

“…Barr, o patógeno mais destrutivo da cultura do arroz (Oryza sativa L.). Nos últimos anos, a técnica REMI, Restriction Enzyme-Mediated Integration (16) tem se destacado por potencializar a geração de mutações no genoma do ascomiceto (1,5,11,17,18,20). REMI envolve a transformação do organismo com o DNA transformante linear na presença de enzima de restrição, geralmente a mesma utilizada para a linearização do vetor (19).…”

“…Recentemente, REMI foi adequada para o emprego do vetor pAN7-1 e a enzima HindIII em M. grisea (11). Tal vetor, apesar de amplamente utilizado em outros sistemas, não tem sido explorado para a mutagênese REMI em M. grisea.…”