Determinação eletroanalítica de corante reativo presente como contaminante em proteínas purificadas por cromatografia de afinidade

Abstract

Recebido em 8/7/03; aceito em 31/10/03 ELECTROANALYTICAL DETERMINATION OF A REACTIVE DYE CURRENTLY USED IN AFFINITY CHROMATOGRAPHY FOR PROTEIN PURIFICATON. Procion Green HE-4BD is a reactive dye currently used in affinity purification, and commonly present as a contaminant in the final biological preparation. An assay method is described to determine trace amounts of the dye in the presence of human serum albumin(HSA) and leakage from agarose as affinity sorbent by cathodic stripping voltammetry. The proposed method is based on the reductive peak at -0.55V in B-R buffer pH 3 (E=0V and t= 240s), obtained when samples of HSA 2% (m/v) containing dye concentrations in sodium hydroxide pH 12 are submitted to a heating time of 330 min at 80 o C. Linear calibration curves can be obtained for RG19 dye concentrations from 5x10 -9 mol L -1 to 8 x10Keywords: triazine dyes; cathodic stripping voltammetry; purified biomaterials. INTRODUÇÃOCorantes reativos são amplamente utilizados como alternativa de menor custo na purificação de proteínas por meio da técnica de cromatografia de afinidade. O grande interesse e alta demanda por proteínas e enzimas com alto grau de pureza torna-se cada vez maior em biotecnologia, bioquímica e medicina e tem contribuído de forma significativa para o crescimento desta área nos últimos anos 1 . A purificação de proteína pelo método de afinidade baseia-se na utilização de colunas contendo suportes derivatizados com corantes reativos, capazes de interagir com proteínas de interesse com alta especificidade 2 . Dentre os diversos tipos de corantes reativos usados para esta finalidade, destacam-se os que contém grupos triazinas como centro reativo [2][3][4][5][6] . Esses corantes são capazes de se ligarem tão fortemente à proteína que esta pode ser separada de misturas extremamente complexas em uma simples etapa de purificação. Esta metodologia tem ganho notoriedade por fornecer um método econômico e confiável para separação de proteínas, utilizando-se como simples etapa suportes modificados por estes corantes. Entretanto, uma das desvantagens freqüentemente mencionadas na utilização destes corantes imobilizados para a purificação de proteínas é quanto ao risco de contaminação da preparação biológica por traços do corante 2 . O corante Procion Green HE-4BD (RG19), Figura 1, pertence à família de corantes reativos que podem ser acoplados a uma enorme variedade de suportes cromatográficos, tais como agarose, celulose, poliacrilamida, sephadex, silica e vidro [6][7][8] . Este corante imobilizado em colunas cromatográficas tem permitido a purificação de uma grande quantidade de proteínas. Para se obter uma extração efetiva, além do requerimento de um alto grau de pureza da proteína obtida como produto final, os suportes usados na fase estacionária e preparados previamente com a etapa de imobilização do corante também devem apresentar um nível de concentração desprezível em corante livre. Deste modo, métodos analíticos cada vez mais sensíveis são requeridos para estas operações.Os métodos analíticos freqü...

Derivative cathodic stripping voltammetry in the simultaneous determination of three textile dyes in aqueous solutions

“…The detection limits were 0.210 9 10 À3 , 0.480 9 10 À3 , and 0.066 mg l À1 respectively, with a relative standard deviation (n = 3) of 1.22%. These results can be compared with findings that described the determination of Procion Green HE-4BD in an aqueous solution [29] and the determination of Reactive Blue using an imprinted carbon working electrode via voltammetry [7]. Other methods have been developed and studied for determining reactive dyes, such as spectrophotometry, capillary electrophoresis, and chromatography [30].…”

Photoelectrocatalytical degradation of basic blue 41 dye using nanoporous semiconductor of Ti/TiO2

“…Considerando que a eficiência desse processo esta relacionada ao tempo de vida das lacunas (h + bv ) e retardamento da velocidade de recombinação das cargas geradas (e -/h + ) no semicondutor, a fotoeletrocatálise tem sido uma metodologia difundida para a ampliação na eficiência, com a aplicação de um potencial ou densidade de corrente externo. Quando a densidade de corrente é aplicada ao semicondutor, há a formação de um gradiente de densidade de corrente que impulsiona o elétron para o contra eletrodo e a lacuna para a superfície do eletrodo, diminuindo a velocidade de recombinação, promovendo um consequente aumento da eficiência fotoeletrocatalítica com a geração de radicais hidroxilas, conforme as equações abaixo [ [3] No entanto a maioria dos trabalhos para tratamento fotoeletrocatalítico de corantes descritos na literatura [15][16][17], são baseados para corantes do tipo disperso, reativo e ácidos, e os trabalhos relacionados com corantes básicos são raros. Deste modo, considerando que cada grupo de corantes pertence a classes distintas com estruturas e propriedades físico-químicas diferentes, é objetivo do presente trabalho investigar a degradação fotoeletrocatalítica do corante azul básico 41 utilizando semicondutor nanoporoso de Ti/TiO 2 em um reator fotoeletroquímico usando irradição UV, visando desenvolver um método alternativo para remoção de corantes do tipo básico.…”

Degradação fotoeletrocatalítica do corante azul básico 41 usando semicondutor nanoporoso de Ti/TiO2

“…Considerando que a eficiência desse processo esta relacionada ao tempo de vida das lacunas (h + bv ) e retardamento da velocidade de recombinação das cargas geradas (e -/h + ) no semicondutor, a fotoeletrocatálise tem sido uma metodologia difundida para a ampliação na eficiência, com a aplicação de um potencial ou densidade de corrente externo. Quando a densidade de corrente é aplicada ao semicondutor, há a formação de um gradiente de densidade de corrente que impulsiona o elétron para o contra eletrodo e a lacuna para a superfície do eletrodo, diminuindo a velocidade de recombinação, promovendo um consequente aumento da eficiência fotoeletrocatalítica com a geração de radicais hidroxilas, conforme as equações abaixo [14] [3] No entanto a maioria dos trabalhos para tratamento fotoeletrocatalítico de corantes descritos na literatura [15][16][17], são baseados para corantes do tipo disperso, reativo e ácidos, e os trabalhos relacionados com corantes básicos são raros. Deste modo, considerando que cada grupo de corantes pertence a classes distintas com estruturas e propriedades físico-químicas diferentes, é objetivo do presente trabalho investigar a degradação fotoeletrocatalítica do corante azul básico 41 utilizando semicondutor nanoporoso de Ti/TiO 2 em um reator fotoeletroquímico usando irradição UV, visando desenvolver um método alternativo para remoção de corantes do tipo básico.…”