Agrobacterium-mediated genetic transformation of 'Hamlin' sweet orange

Abstract

The development and optimization of efficient transformation protocols is essential in new citrus breeding programs, not only for rootstock, but also for scion improvement. Transgenic Hamlin sweet orange (Citrus sinensis (L.) Osbeck) plants were obtained by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of epicotyl segments collected from seedlings germinated in vitro. Factors influencing genetic transformation efficiency were evaluated including seedling incubation conditions, time of inoculation with Agrobacterium and co-culture conditions. Epicotyl segments were adequate explants for transformation, regenerating plants by direct organogenesis. Higher percentage of transformation was obtained with explants collected from seedlings germinated in darkness, transferred to 16 hours photoperiod for 2-3 weeks, and inoculated with Agrobacterium for 15-45 min. The best co-culture condition was the incubation of the explants in darkness, for three days in culture medium supplemented with 100 µM of acetosyringone. Genetic transformation was confirmed by performing ß-glucoronidase (GUS) assays and, subsequently, by PCR amplification for the nptII and GUS genes.Index terms: Citrus sinensis, epicotyls, seedlings, transgenics, breeding methods. Transformação genética de laranja Hamlin via AgrobacteriumResumo O desenvolvimento e otimização de protocolos eficientes de transformação genética é essencial nos programas atuais de melhoramento de citros, tanto para porta-enxertos, como para copas de valor comercial. Plantas transgênicas de laranja Hamlin (Citrus sinensis (L.) Osbeck) foram obtidas pela transformação genética de segmentos de epicótilo, coletados de plântulas germinadas in vitro, com Agrobacterium tumefaciens. Foram avaliados fatores que influenciam a eficiência da transformação genética, como: condições de incubação das plântulas utilizadas para coleta de explantes, tempo de inoculação com Agrobacterium e condições de co-cultivo. A regeneração de plantas a partir de segmentos de epicótilo ocorreu em alta freqüência, por organogênese direta. A maior porcentagem de plantas transgênicas foi obtida utilizando-se explantes coletados de plântulas germinadas no escuro e posteriormente transferidas, por 2-3 semanas, para condições de 16 horas de fotoperíodo, e infectados com Agrobacterium por um período de 15-45 minutos. As melhores condições de co-cultivo foram a incubação dos explantes no escuro, por três dias, em meio de cultura suplementado com 100 µM de acetoseringona. A transformação genética foi confirmada pelo teste histoquímico para ß-glucoronidase (GUS) e, posteriormente, pela amplificação de DNA, por PCR, para detecção dos genes nptII e GUS.Termos para indexação: Citrus sinensis, epicótilo, plântulas, transgênicos, métodos de melhoramento.

Transformação genética de laranja doce (Citrus sinensis L. Osbeck) com o gene cecropin MB39 e avaliação de plantas transgênicas inoculadas com Xylella fastidiosa Wells et al.

“…A primeira laranja transgênica regenerada foi obtida a partir de células embriogênicas em suspensão da variedade 'Washington Navel' co-cultivadas com Agrobacterium tumefaciens (HIDAKA et al, 1990). Vários métodos de transformação genética já foram descritos para citros, como a introdução direta de DNA em protoplastos (KOBAYASHI; UCHIMIYA, 1989;VARDI;BLEICHMAN;AVIV, 1990;GUO et al, 2005), transformação via A. tumefaciens (MOORE et al, 1992;FLEMING et al, 2000;BOND;ROOSE, 1998;CERVERA et al, 1998;MOORE, 1999;MENDES et al, 2002;ALMEIDA et al, 2003), o bombardeamento de partículas em células vivas (KLEIN et al, 1987;YAO et al, 1996) e por eletroporação de protoplastos (HIDAKA; OMURA, 1993;NIEDZ et al, 2003).…”

“…Diversos fatores podem afetar a eficiência de transformação, como o cultivo (CERVERA et al, 1998;PEÑA et al, 1997), a estirpe de Agrobacterium (HOLFORD; HERNANDEZ; NEWBURY, 1992; GUTIÉRREZ-E; LUTH; MOORE, 1997), o tipo de explante (MOORE et al, 1992;FLEMING et al, 2000;MENDES et al, 2002), o genótipo utilizado , e as condições de incubação no co-cultivo (BARBOSA, 2002;MENDES et al, 2002).…”

“…Trabalhos mais recentes vêm mostrando um considerável aumento na eficiência de transformação, como 20,6% a 80% para citrange 'Carrizo' (PEÑA et al, 1995b;YU et al, 2002), 15% a 18,6% para laranja 'Hamlin' (MENDES et al, 2002;BOSCARIOL, 2004) e 87,7% para Poncirius trifoliata (KANEYOSHI et al, 1994).…”

“…As estirpes de A. tumefaciens mais utilizadas são a EHA105 e EHA101, sendo essas as que mostraram melhores resultados (PEÑA et al, 1995b;MENDES et al, 2002). A freqüência de transformação da estirpe EHA105 é 22 vezes maior que a da estirpe C58 (GHORBEL et al, 2001).…”

“…A produção do pomar afetado cai rapidamente, os frutos ficam duros, pequenos e amadurecem precocemente. A perda de peso do fruto pode chegar a 75% (FUNDECITRUS, 2007 (MOORE et al, 1992;MENDES et al, 2002). Entretanto, a maioria das plantas transgênicas de citros produzidas atualmente, foram regeneradas utilizando-se promotores constitutivos fortes como o CaMV 35S (PEÑA et al, 1997;ALMEIDA et al, 2003;MOLINARI et al, 2004 Embora ocupe uma posição de destaque no mercado, nossa produtividade média, em torno de 2,0 caixas/planta/ano, ainda é baixa, quando comparada com outras regiões produtoras, como por exemplo, a Flórida, que alcança uma média de 6,0 caixas/planta/ano.…”