Método imunocitoquímico para a identificação de amastigotas do Trypanosoma cruzi em cortes histológicos de rotina

Abstract

RESUMOA técnica da peroxidase antiperoxidase foi aplicada para a identificação de amastigotas do T. cruzi em cortes histológicos de rotina. Os tecidos foram obtidos de pacientes chagásicos crônicos e de animais na fase aguda da infecção chagásica. Anti-soros específicos produzidos em coelho contra as cepas CL, Y e Emane do T. cruzi foram utilizados como reagentes primários na técnica imunocitoquímica. Soro de coelho normal foi utilizado como controle negativo e culturas de ma¬ crófagos peritoniais de camundongos infectados com trípomastigotas e apresentando abundantes' amastigotas intracelulares foram utilizadas como controles positivos. Coloração positiva ocorreu especificamente nos amastigotas intra e extracelulares em todos os tecidos testados com os anti-soros contra as três diferentes cepas do T. cruzi. Os amastigotas isolados ou formando ninhos intracelulares tornaram-se facilmente identificáveis nas preparações histológicas utilizando-se o pequeno ou médio aumento do microscópio. O presente método aumenta a probabilidade do diagnóstico do parasitismo na doença de Chagas, e evita confundir-¬ se amastigotas com outros microrganismos morfologicamente semelhantes. INTRODUÇÃOA identificação de formas amastigotas do T. cruzi em cortes histológicos utilizando técni-cas convencionais de coloração é difícil e frequentemente os resultados positivos dependem de grande número de cortes e exame microscó-pico exaustivo utilizando-se objetiva de grande aumento. Mesmo nestes casos, a identificação dos amastigotas só é possível quando se encontram ninhos intracelulares típicos porque os parasitas se coram inespecificamente com os corantes básicos a semelhança de outras estruturas celulares. Nos casos de tecidos provenientes de animais na fase aguda da infecção, a identificação rotineira dos parasitas torna-se relativamente fácil apenas porque são mais freqüentes; entretanto, continua difícil o diagnós-tico daqueles isolados ou com localização extracelular. Clinicamente a doença de Chagas é mais importante na fase crônica quando as lesões teciduais são mais graves; entretanto, nesta fase, torna-se escasso o número de parasitas 4 . Na chamada fase "indeterminada" da doença pouco se sabe a respeito da evolução das lesões, bem como da quantidade relativa e características do parasitismo. Recentemente, alguns Autores tem mostrado que a presença de parasitas no tecido na fase crônica da doença de Chagas, mesmo em sedes insólitas, pode ser mais freqüente do que o presentemente conhecido Portanto, o estudo da patologia da doença de Chagas carece de método histológico que facilite o reconhecimento de amastigotas no tecido, tanto com finalidade diagnostica como para tornar mais preciso o estudo quantitativo do parasitismo nos diversos órgãos e tecidos.

Myocardial parasite persistence in chronic chagasic patients.

“…Detecting persistent T. cruzi amastigote tissue forms in the hearts of cases with chronic diseases was made possible using methods based on new biotechnology that allowed the sampling and the specific identification of the parasite in those patients previously diagnosed by classical routine methods of having T. cruzi infections. These include the EMB, a low-risk heart invasive method, 15 which when combined with the molecular PCR system, the most sensitive technique available for direct detection of T.cruzi in patients with Chagas' disease, 25 and the PAP technique, a highly specific immunohistochemical technique, 16 made it possible to accurately identify the presence of T.cruzi in the myocardium of these patients.…”

“…2 Two immunohistochemical methods were used to study the EMB: an indirect immunofluorescence test (IIT) for tissue samples to detect antigenic deposits on cardiac tissue using specific antibodies contained in serum sample from the same patient, and a PAP technique for detecting T. cruzi amastigotes in a heart sample. 16 Both tests were performed on biopsy specimens fixed in 10% buffered formaldehyde, embedded in paraffin, sectioned (2-5 ), placed on a glass slide covered with poly-L-lysine (1: 9), dried overnight, and then processed for either technique. Observations were made with a Zeiss (Jena, Germany) Axioscop DIC light microscope fitted with an HBO 50 fluorescent lamp and a MC80 camera.…”

Rat adrenal gland in experimental american trypanosomiasis : immunocytochemical study of tissue parasitism

“…Rabbit antiserum against T. cruzi, CL strain, was used at 1 : 1,000 dilution (Barbosa, 1985). The areas occu pied by cortical and medullary tissues were planimetrically deter mined in each section used for T. cruzi amastigote counting.…”

Estudo comparativo entre o método convencional e o método da peroxidase anti-peroxidase na pesquisa do parasitismo tissular na cardiopatia chagásica crônica

“…No coração, principal órgão de choque da doença, apesar de muitas vezes apresentar miocardite relativamente acentuada, não se demonstra a presença do parasita, pelo menos através de exames histológicos rotineiros • í . Por outro lado, quando se procedem a exames sistematizados tanto do coração l , como de outros órgãos 2 P a freqüência dos achados do parasita aumenta, às vezes inesperadamente, demons- Com a recente utilização de método imunocitoquímico pela peroxidase anti-peroxidase (PAP) para a demonstração do T. cruzi em tecidos incluídos em parafina 5 abrem-se as portas de uma metodologia nova e altamente específica para estudo do parasitismo tissular na doença de Chagas humana e na tripanosomose cruzi experimental. Entretanto, sendo o método relativamente mais caro e complexo que os rotineiros, a sua utilização para quantificar o parasitismo em tecidos de chagásicos crônicos somente valeria a pena se, além de facilitar o diagnóstico e ser mais específico, também demonstrasse maior número de parasitas, aumentando sensivelmente a probabilidade do diagnós-tico dos mesmos e revelando formas parasitárias que não poderiam ser evidenciadas pelos métodos convencionais.…”

“…O anti soro utilizado, de n.° 41. apresenta título de anticorpos anti-T. cruzi de 1:1280 à imunofluorescência indireta e alta taxa de anticorpos líticos anti-T cruzi, como evidenciada pela reação de lise mediada por complemento 9 . O anti-soro foi diluído em tampão fosfato salino (PBS), pH 7,2 na proporção de 1:1000 e aplicado sobre os cortes que foram incubados em câmara ümida a 4°C por 18 horas, conforme utilizado em trabalho anterior 5 . Anteriormente a esta primeira camada de anticorpos os cortes foram tratados com peróxido de hidrogênio para bloquear a peroxidase endógena e após lavagens repetidas em PBS, foram incubados com soro normal de cabra uma vez que se utilizou como anticorpo de ligação IgG de cabra anti-IgG de coelho (MilesYeda Ltd., Israel (Figs.…”