CRISPR-Cas defense systems opened up the field of genome editing due to the ease with which effector Cas nucleases can be programmed with guide RNAs to access desirable genomic sites. Type II-A SpCas9 from Streptococcus pyogenes was the first Cas9 nuclease used for genome editing and it remains the most popular enzyme of its class. Nevertheless, SpCas9 has some drawbacks including a relatively large size and restriction to targets flanked by an ‘NGG’ PAM sequence. The more compact Type II-C Cas9 orthologs can help to overcome the size limitation of SpCas9. Yet, only a few Type II-C nucleases were fully characterized to date. Here, we characterized two Cas9 II-C orthologs, DfCas9 from Defluviimonas sp.20V17 and PpCas9 from Pasteurella pneumotropica. Both DfCas9 and PpCas9 cleave DNA in vitro and have novel PAM requirements. Unlike DfCas9, the PpCas9 nuclease is active in human cells. This small nuclease requires an ‘NNNNRTT’ PAM orthogonal to that of SpCas9 and thus potentially can broaden the range of Cas9 applications in biomedicine and biotechnology.

Bacteriophage ΦKZ (PhiKZ) is the archetype of a family of massive bacterial viruses. It is considered to have therapeutic potential as its host, Pseudomonas aeruginosa, is an opportunistic, intrinsically antibiotic resistant, pathogen that kills tens of thousands worldwide each year. ΦKZ is an incredibly interesting virus, expressing many systems that the host already possesses. On infection, it forms a ‘nucleus’, erecting a barrier around its genome to exclude host endonucleases and CRISPR-Cas systems. ΦKZ infection is independent of the host transcriptional apparatus. It expresses two different multi-subunit RNA polymerases (RNAPs): the virion RNAP (vRNAP) is injected with the viral DNA during infection to transcribe early genes, including those encoding the non-virion RNAP (nvRNAP), which transcribes all further genes. ΦKZ nvRNAP is formed by four polypeptides thought to represent homologues of the eubacterial β/β′ subunits, and a fifth with unclear homology, but essential for transcription. We have resolved the structure of ΦKZ nvRNAP to better than 3.0 Å, shedding light on its assembly, homology, and the biological role of the fifth subunit: it is an embedded, integral member of the complex, the position, structural homology and biochemical role of which imply that it has evolved from an ancestral homologue to σ-factor.

Type II CRISPR–Cas9 RNA-guided nucleases are widely used for genome engineering. Type II-A SpCas9 protein from Streptococcus pyogenes is the most investigated and highly used enzyme of its class. Nevertheless, it has some drawbacks, including a relatively big size, imperfect specificity and restriction to DNA targets flanked by an NGG PAM sequence. Cas9 orthologs from other bacterial species may provide a rich and largely untapped source of biochemical diversity, which can help to overcome the limitations of SpCas9. Here, we characterize CcCas9, a Type II-C CRISPR nuclease from Clostridium cellulolyticum H10. We show that CcCas9 is an active endonuclease of comparatively small size that recognizes a novel two-nucleotide PAM sequence. The CcCas9 can potentially broaden the existing scope of biotechnological applications of Cas9 nucleases and may be particularly advantageous for genome editing of C. cellulolyticum H10, a bacterium considered to be a promising biofuel producer.

Cas12e proteins (formerly CasX) form a distinct subtype of Class II type V CRISPR-Cas effectors. Recently, it was shown that DpbCas12e from Deltaproteobacteria and PlmCas12e from Planctomycetes can introduce programmable double-stranded breaks in mammalian genomes. Thus, along with Cas9 and Cas12a Class II effectors, Cas12e could be harnessed for genome editing and engineering. The location of cleavage points in DNA targets is important for application of Cas nucleases in biotechnology. DpbCas12e was reported to produce extensive 5ʹ-overhangs at cleaved targets, which can make it superior for some applications. Here, we used high throughput sequencing to precisely map the DNA cut site positions of DpbCas12e on several DNA targets. In contrast to previous observations, our results demonstrate that DNA cleavage pattern of Cas12e is very similar to that of Cas12a: DpbCas12e predominantly cleaves DNA after nucleotide position 17–19 downstream of PAM in the non-target DNA strand, and after the 22 nd position of target strand, producing 3–5 nucleotide-long 5ʹ-overhangs. We also show that reduction of spacer sgRNA sequence from 20nt to 16nt shifts Cas12e cleavage positions on the non-target DNA strand closer to the PAM, producing longer 6–8nt 5ʹ-overhangs. Overall, these findings advance the understanding of Cas12e endonucleases and may be useful for developing of DpbCas12e-based biotechnology instruments.

1 Всероссийский научно-иссле-довательский институт сельско-хозяйственной микробиологии, Санкт-Петербург; 2 Санкт-Петербургский государс-твенный политехнический универ-ситет; 3 Центр «Биоинженерия» РАН, Москва хитоолигосахариды находят C широкое практическое применение, что определяет интерес к изу-чению возможности биосинтеза этих соединений. В данной работе осуществлен синтез гекса-N-аце-тилхитогексаозы и пента-N-аце-тилхитопентаозы в клетках e. coli с использованием уникального фер-мента N-ацетилглюкозаминилтранс-феразы клубеньковых бактерий Rhizobium sp. grh2 и m. loti. При культивировании бактерий e. coli, экспрессирующих рекомбинантные ферменты, в присутствии субстра-та N-ацетилглюкозамина, уро-вень синтеза хитоолигосахаридов достигал нескольких миллиграмм на литр жидкой культуры. Анализ полученных соединений с помощью методов ВЭЖх и масс-спектро-метрии подтвердил их соответствие стандартам.ключевые слова: C хитоолигосаха-риды; ферментативный синтез; N-аце-тилглюкозаминилтрансфераза.бИосИнтез гекса-И пентамерных хИтоолИгосахарИдов с помощью n-ацетИлглюкозамИнИлтрансферазы рИзобИальных бактерИй ВВЕДЕНИЕ Значительный интерес к изучению олигосахаридов (как конъюгирован-ных, так и свободных) связан с их особой ролью в процессах межклеточного взаимодействия, в основе которых лежит узнавание этих соединений повер-хностными рецепторами клеток у различных организмов (Gagneux, Varki, 1999). Конъюгированные олигосахариды входят в состав гликопротеинов и гликолипидов, углеводные части которых являются специфическими ли-гандами для многих рецепторов. Свободные олигосахариды также вовлечены в лиганд-рецепторные взаимодействия, выполняя во многих случаях функ-цию сигнальных молекул, регулирующих различные биохимические, имму-нологические и морфогенетические процессы. Отдельную группу составляют олигосахариды, которые содержат в своем составе аминосахара D-глюкоза-мин, D-галактозамин, а также N-ацетил-D-глюкозамин и N-ацетил-D-га-лактозамин. Эти соединения выполняют ряд важных функций у различных организмов, поэтому им будет уделено основное внимание в данной работе.У человека и позвоночных животных конъюгированные с гликопротеина-ми и гликолипидами мембран эритроцитов олигосахариды, состоящие из ос-татков N-ацетил-D-галактозамина, определяют специфичность групп кро-ви человека (ABO система). Олигосахариды грудного молока, содержащие в своем составе N-ацетил-D-глюкозамин, действуют как ростовые факторы для Bifidobacterium bifidum и вместе с тем участвуют в подавлении развития патогенной микрофлоры Shigella sp., Helicobacter jejuni, Vibrio cholerae, Salmonella sp. (подавление адгезии бактерий в результате лиганд-рецеп-торных взаимодействий) (Kunz et al., 2000). Состоящие из остатков амино-сахаров олигосахариды, а также полисахариды (гиалуроновая кислота, хон-дроитин-сульфаты, дерматансульфаты, гепарин, кератин) входят в состав межклеточного вещества почти всех видов соединительной, костной и хряще-вой тканей позвоночных животных и человека, они обнаружены в эпителиаль-ной и нервной тканях. Эти соединения участвуют в регул...