(2013) Cloning and expression of an anti-LDL(-) single-chain variable fragment, and its inhibitory effect on experimental atherosclerosis, mAbs, 5:5, 763-775,

The electronegative low-density lipoprotein, LDL (−), is an endogenously modified LDL subfraction with cytotoxic and proinflammatory actions on endothelial cells, monocytes, and macrophages contributing to the progression of atherosclerosis. In this study, epitopes of LDL (−) were mapped using a phage display library of peptides and monoclonal antibodies reactive to this modified lipoprotein. Two different peptide libraries (X6 and CX8C for 6- and 8-amino acid-long peptides, respectively) were used in the mapping. Among all tested peptides, two circular peptides, P1A3 and P2C7, were selected based on their high affinities for the monoclonal antibodies. Small-angle X-ray scattering analysis confirmed their structures as circular rings. P1A3 or P2C7 were quickly internalized by bone marrow-derived murine macrophages as shown by confocal microscopy. P2C7 increased the expression of TNFα, IL-1 β and iNOS as well as the secretion of TNFα, CCL2, and nitric oxide by murine macrophages, similar to the responses induced by LDL (−), although less intense. In contrast, P1A3 did not show pro-inflammatory effects. We identified a mimetic epitope associated with LDL (−), the P2C7 circular peptide, that activates macrophages. Our data suggest that this conformational epitope represents an important danger-associated molecular pattern of LDL (−) that triggers proinflammatory responses.

No abstract

Atherosclerosis is a systemic disease characterized by the development of multifocal plaque lesions within vessel walls and extending into the vascular lumen. The disease takes decades to develop symptomatic lesions, affording opportunities for accurate detection of plaque progression, analysis of risk factors responsible for clinical events, and planning personalized treatment. Of the available molecular imaging modalities, radionuclide-based imaging strategies have been favored due to their sensitivity, quantitative detection and pathways for translational research. This review summarizes recent advances of radiolabeled small molecules, peptides, antibodies and nanoparticles for atherosclerotic plaque imaging during disease progression.

Expressão de fragmentos variáveis de cadeia simples anti-LDL eletronegativa (scFv) em Pichia pastoris e seu efeito sobre a formação de células espumosas Soraya Megumi Kazuma Dissertação para Obtenção de grau de MESTRE Orientadora: Profª Drª Dulcineia Saes Parra Abdalla São Paulo 2010 Dedico este trabalho a Deus, aos meus pais, aos meus irmãos,meu namorado e amigos pelo amor, apoio e compreensão. 6 AGRADECIMENTOS A Deus, por me fornecer toda a força necessária para superar todos os obstáculos. A Dulcineia, pela oportunidade de aprendizado em um laboratório de pesquisa. Aos meus pais Jorge e Neuza, meus irmãos Ayumi e Leandro, meus sobrinhos Lucas, Gabriel, Mateus e Aya, por todo o amor, carinho, apoio e compreensão e por serem a base da minha vida. Ao meu namorado Dan, por ser meu alicerce para os momentos difíceis, por todo o seu amor e companheirismo e aos pais dele, Teresa e Kojiro, por me acolherem de braços abertos. A tia Eliza e tio Akio e aos meus primos-irmãos Adriana e Marcel, por todo o amor, carinho, apoio, compreensão, e pela moradia quando cheguei a São Paulo. Aos meus avós Yoshio e Taeko, meus tios Choiti, Lina, Luiza e Jorge, e primas Aline e Jéssica que desde o início do mestrado sempre acreditaram em mim e me apoiaram muito. Aos meus amigos do laboratório Tanize, pela amizade, carinho, apoio, ajuda e ensinamentos; Marcela, Fernanda Gomes e Daniel, pela ajuda, compreensão e amizade nesta etapa final; Fernanda Cesar, Martina, Luciane e Cris pela amizade, carinho, apoio e por toda ajuda com as células; Julio, pela amizade, carinho, apoio e por me apelidar de JoJo; Elaine pela amizade, ajuda e todas as sugestões que contribuíram para o trabalho; ao Leo e a Pri, pela amizade e pelas boas risadas no laboratório; a Cris Garcia, pela amizade e por ter me ensinado muito sobre Biologia Molecular; ao Alejandro, pela amizade e pelas sugestões para o trabalho e as pessoas novas que entraram recentemente no grupo Thais e Ricardo.ABSTRACT The modification products of low-density lipoprotein (LDL), as the electronegative subfraction [LDL(-)], play an important role in the progression of atherosclerosis. The massive accumulation of modified LDL uptake by macrophages results in foam cells that release inflammatory mediators and contribute to atherogenesis. The scFv (singlechain fragment variable) is a recombinant antibody fragment that contains the complete site antigen-binding. Considering the role of LDL(-) in atherogenesis and the need for new therapeutic interventions that may inhibit the accumulation of lipids in macrophages, this study aimed the expression of anti-LDL(-) 2C7 scFv in Pichia pastoris and the evaluation of the effect of this recombinant antibody fragment on foam cells formation in cultured RAW 264.7 macrophages. The pPIgLE expression initial vector presented as a strategy for detection and purification the fusion with protein A. PMSF Fluoreto de Fenilmetilsulfonil P. pastoris Pichia pastoris PRR Receptor de reconhecimento padrão (Pattern Recognition Receptor) scFv Fragmento variável de anticorpo...

No abstract

Atherosclerosis can be originated from the accumulation of modified cholesterol-rich lipoproteins in the arterial wall. The electronegative LDL, LDL(-), plays an important role in the pathogenesis of atherosclerosis once this cholesterol-rich lipoprotein can be internalized by macrophages, contributing to the formation of foam cells, and provoking an immune-inflammatory response. Herein, we engineered a nanoformulation containing highly pure surface-functionalized nanocapsules using a single-chain fragment variable (scFv) reactive to LDL(-) as a ligand and assessed whether it can affect the LDL(-) uptake by primary macrophages and the progression of atherosclerotic lesions in Ldlr−/− mice. The engineered and optimized scFv-anti-LDL(-)-MCMN-Zn nanoformulation is internalized by human and murine macrophages in vitro by different endocytosis mechanisms. Moreover, macrophages exhibited lower LDL(-) uptake and reduced mRNA and protein levels of IL1B and MCP1 induced by LDL(-) when treated with this new nanoformulation. In a mouse model of atherosclerosis employing Ldlr−/− mice, intravenous administration of scFv-anti-LDL(-)-MCMN-Zn nanoformulation inhibited atherosclerosis progression without affecting vascular permeability or inducing leukocytes-endothelium interactions. Together, these findings suggest that a scFv-anti-LDL(-)-MCMN-Zn nanoformulation holds promise to be used in future preventive and therapeutic strategies for atherosclerosis.

AGRADECIMENTOSAgradeço primeiramente à Deus, por ser tão abençoada em todos os aspectos, e por ele ter me dado forças para sempre continuar batalhando e nunca perder a fé.Agradeço à minha orientadora, Dulcineia, por me conferir a oportunidade e por confiar à realização desse projeto inovador e desafiador.Agradeço ao meu marido Dan, pelo apoio e amor incondicional, e por ser um grande companheiro com quem posso contar sempre. Agradeço a minha família, meus pais Jorge e Neuza, irmãos Leandro e Simone, cunhada Adriana (in memoriam), sobrinhos Lucas, Gabriel, Aya e Ryo e primos Adriana, Leonardo, Marcel, meus tios Eliza e Missao, meus sogros Kojiro e Naomi, sendo sempre meu grande suporte para todos os momentos.Agradeço aos amigos de laboratório Marcela, que além da ajuda nos experimentos e trabalho, sempre dando grandes conselhos, servindo de ombro amigo sempre, ao especialista de laboratório Walter, pelo excelente profissionalismo e ajuda com todos os experimentos de microPET, ao Gustavo e Jacqueline, pela amizade, companheirismo com assuntos do lab, e principalmente pelos momentos espontâneos e engraçados. Agradeço também aos amigos que já trabalharam conosco mas que seguiram outros caminhos, Tanize, sempre um exemplo de pessoa e profissional, Felipe, Elaine e Martina, pela amizade e grande ajuda nos experimentos.Agradeço ao Dr Liu e toda sua equipe de pesquisa, Debbie, Hannah, Lisa, Yongfeng e Meng por me receber de braços abertos em seu laboratório na Washington University in St Louis, e com muita paciência possibilitou que grande parte desse projeto fosse realizado. A aterosclerose é caracterizada como uma doença imune-inflamatória crônica das artérias devido ao grande acúmulo de lipídios na íntima. Um dos fatores envolvidos na progressão da aterosclerose é a presença de uma subfração de partículas de lipoproteína de baixa densidade (LDL) com um grau mínimo de modificação, denominada LDL eletronegativa [LDL(-)], que possui propriedades pró-inflamatórias, apresenta maior retenção na íntima das artérias e maior tempo de permanência na circulação sanguínea, gerando respostas imuno-inflamatórias. Epítopos de anticorpos monoclonais importantes no reconhecimento das partículas de LDL(-) foram mapeados por phage display, gerando peptídeos mimotopos (P1A3 e P2C7) com potencial para acompanhamento da progressão da aterosclerose, sendo excelentes candidatos como radiotraçadores marcados com emissores de pósitrons para obtenção de imagens moleculares por tomografia por emissão de pósitrons (PET) associada à tomografia computadorizada (PET/CT). O peptídeo P1A3 foi radiomarcado com 64 Cu através da complexação com o quelante DOTA, obtendo-se imagens por PET/CT da captação do peptídeo na região do arco aórtico de camundongos knockout para a apolipoproteína E (Apoe -/-) comparados com animais controle sem lesões ateroscleróticas. Antes da obtenção das imagens PET/CT, os peptídeos radiomarcados foram validados através de estudos de estabilidade e biodistribuição, acumulando-se rapidamente nos rins. Também foi sintetizado um n...