An indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ic-ELISA) for ochratoxin A (OTA)

The performance of an indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ic-ELISA) based on a monoclonal antibody (mAb) for ochratoxin A (OTA) detection was evaluated in a comparative study with high-performance liquid chromatography (HPLC) analysis using 68 freshly harvested coffee samples from the North of Paraná State, Brazil. The anti-OTA mAb showed high specificity and low cross-reactivity with OTA analogues (OTB and OTalpha), but cross-reacted with OTC. This ic-ELISA showed a detection limit of 3.75 ngg-1 sample, when compared to 0.80 ngg-1 by HPLC, with an ic-ELISA/HPLC correlation coefficient of 0.90. As regards OTA analysis of these coffee samples, natural contamination was detected in 10 samples (14.7%) by both methods, where the ic-ELISA values (range 3.9-7.3 ngg-1) were 1.1 to 1.6-fold higher than HPLC data (2.7-4.7 ngg-1). Five samples (7.4%) were OTA positive (range 0.84-1.30 ngg-1) only by HPLC assay, probably due to the higher detection limit reached by ic-ELISA. OTA was undetectable in 53 samples (77.9%) by both methods, while all positive samples (range 0.84-7.30 ngg-1) showed OTA levels lower than 8 ngg-1 (maximum limit recommended by the European Union). The matrix interference of green coffee was minimized by dilution of sample extracts before carrying out the ELISA assay. This mAb-based ic-ELISA can be effectively applied for OTA screening in coffee, because it is simple, sensitive and sample preparation is easy.

A cafeicultura brasileira se destaca no mercado interno e comércio exterior, com ênfase a contaminação fúngica e ocratoxina A (OTA). A cafeína destaca-se entre os componentes naturais de defesa capazes de inibir produção de micotoxinas em café, inclusive a ocratoxina A (OTA), que vem constituindo num dos tópicos primordiais no controle de qualidade no mundo globalizado. Considerando que a garantia de matéria prima através de técnicas moleculares apresenta sérias barreiras na segurança alimentar, o constante monitoramento de toxinas ainda constitui opção para solução imediata do problema. As desvantagens inerentes à metodologia analítica química estimularam o emprego de imunoensaio "enzyme linked immunosorbent assay" (ELISA) e colunas de imunoafinidade como alternativas promissoras na detecção de OTA em alimentos. Visando garantir a qualidade de café sob o tópico de segurança alimentar, a revisão discerne sobre cafeína como componente de defesa natural de planta, aliado a métodos simples de elevada sensibilidade, indispensáveis no diagnóstico rápido de ocratoxinas a nível de campo.

The aim of this study was to evaluate the effect of partially purified Fusarium verticillioides fumonisins (FB) on the specific humoral response in mice infected with Paracoccidioides brasiliensis (Pb), the agent of paracoccidioidomycosis (PCM). Four groups of male Swiss mice were used (total 44 mice): infected (Pb), treated (FB), infected and treated (Pb/FB) and uninfected and untreated (PBS). Groups Pb and Pb/FB were inoculated i.v. with 1x105 Pb yeast cells (strain Pb18) and, after 28 days, groups FB and Pb/FB were inoculated (s.c.) with partially purified FB from F. verticillioides (5x2.25 mg FB/kg body weight). After 7 days, the plasma levels of total IgG and anti-gp43 IgG (specific antibody) were analysed by immunoenzyme assay (ELISA). The total IgG level was higher in groups Pb, FB and Pb/FB than in PBS (P<0.05) and the anti-gp43 IgG level was raised in groups Pb and Pb/FB, but a significant result was obtained only in Pb/FB, relative to the other groups (P<0.05). In conclusion, FB or other components of F. verticillioides extracts significantly increase the specific antibody response in male Swiss mice infected with Pb.

Fumonisins are mycotoxins produced mainly by Fusarium verticillioides, which can modulate the immune response. Paracoccidioidomycosis (PCM), caused by the fungus Paracoccodioides brasiliensis (Pb), is one of the most important systemic mycoses in Latin America. The aim of this study was to evaluate the effect of the partially purified fumonisins on cellular immune response in mice infected with Pb. Four groups of male BALB/c mice were used. Groups PB and PB/FB were inoculated i.v. with 1 × 10 5 Pb yeast cells and, after 28 days, groups FB and PB/FB were inoculated (s.c.) with partially purified fumonisin B 1 from F. verticillioides (5 × 2.25 mg FB1/kg body weight). After 7 days, cellular immune response was evaluated by delayed-type hypersensitivity (DTH) and lymphoproliferative assays (LA) using spleen cells. Nitric oxide (NO) production by spleen cells was also evaluated. The specific LA response to Pb antigen was higher in group PB than in FB and CTR groups (p< 0.05) but not significant with PB/FB. The DTH response was higher in infected than non infected groups (p<0.05) but also no significantly with PB and PB/FB groups. The lyphoproliferative response to ConA was decreased in FB or PB/FB in relation to CTR (p<0.05) but not with PB/FB and also a reduction of NO levels was observed in fumonisin treated in relation to control group FB1/kg (p<0.05). In conclusion, fumonisin B 1 or other components of F. verticillioides extracts significantly suppress the unspecific cellular immune response and the NO production by splenocytes from P. brasiliensis infected or not infected BALB/c mice.

ResumoAflatoxina B 1 (AFB 1 ) é uma micotoxina classificada pela International Agency for Research on Cancer -IARC no Grupo 1 (carcinógeno ao humano), responsável pelo perigo de contaminação em ampla variedade de alimento e ração, cujo monitoramento depende de metodologia analítica precisa e exata. O trabalho objetivou no cultivo do hibridoma secretor de anticorpo monoclonal (AcM) específico para AFB 1 visando desenvolvimento de métodos imunoquímicos. Hibridoma AF2 foi cultivado em meio RPMI + 15 % de soro fetal bovino (SFB), assim como o mesmo meio com adição gradual de meio H-SFM (25, 50, 75 e 100 % H-SFM). A concentração proteica obtida no sobrenadante de cultura variou de 1,80 a 10,88 mg/mL. A introdução de meio sintético H-SFM isento de SFB permitiu obtenção de reagente com maior pureza e menor perigo, já que cultivos com maior proporção de H-SFM apresentou menor teor proteico (2,29 mg/mL em 100 % de H-SFM), sendo este provavelmente próximo ao teor real de AcM puro. O ensaio imunoenzimático competitivo indireto (ic-ELISA) e eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS (SDS-PAGE) demonstraram atividade antiAFB 1 e bandas correspondentes ao IgG, respectivamente, indicando viabilidade da aplicação de AcM produzido em 100, 75 e 50 % H-SFM para o desenvolvimento de bioferramentas para detecção de AFB 1 . Esta produção de AcM abre perspectiva perante autossuficiência de reagentes essenciais no diagnóstico rápido em condição nacional, contribuindo na qualidade e segurança de alimentos.

ResumoA cafeicultura brasileira apresenta grande importância ao mercado interno e comércio exterior. A qualidade e sanidade do café dependem da contaminação fúngica, com ênfase as espécies produtoras de ocratoxina A (OTA), uma nefrotoxina de efeito deletério à saúde pública. A necessidade de contínuo monitoramento e controle de OTA em produtos agrícolas requer metodologia analítica simples, rápida e acessível. O trabalho teve como objetivo padronizar um método espectrofluorimétrico para detecção de OTA visando monitoramento em grãos de café, correlacionando-o com a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A aplicabilidade da espectrofluorimetria foi avaliada em café artificialmente contaminado com OTA (10, 20 e 50 ng/g), comparando os resultados obtidos com a CLAE. Embora a fluorimetria tenha apresentado resultados insatisfatórios, com recuperação de 40,14 % e coeficiente de correlação de 0,79 em relação a CLAE, i.e. baixa confiabilidade e eficiência inadequada, a técnica constitui perspectiva para prosseguir o estudo inserindo novos ensaios referentes à sua padronização e certificação. Palavras-chave: Ocratoxina A, café, CLAE, espectrofluorimetria AbstractThe Brazilian coffee production plays important role both in the national and oversea trade. The quality and sanity of coffee depend on fungal contamination, with emphasis on ochratoxin A (OTA) producing species, which is a nephrotoxin with hazardous effect in public health. The exigency on continuous monitoring and control of OTA in agricultural commodity requires a simple, rapid and accessible analytical methodology. The objective of this research was to set up the spectrofluorimetric method for OTA detection intended for monitoring in coffee, which was developed in data-correlation with high efficiency liquid chromatography (HPLC). The performance of spectrofluorimetric analysis was evaluated using artificially contaminated coffee (10, 20 and 50 ng/g), and the data compared with HPLC. Although of the fault of former technique, with recovery of 40.14 % and correlation coefficient of 0.79 when compared to HPLC, i.e. low reliability and inadequate efficiency, the data showed perspective to follow the improvement inserting new tool, and further standardization and certification.

O presente trabalho visa verificar como os tipos psicológicos influenciam no cotidiano de um casal e como se dá a manutenção deste vínculo no dia-a-dia, tendo como teoria de base os tipos psicológicos descritos por Carl G. Jung. Analisa a dinâmica dos tipos psicológicos sob duas perspectivas: a intrapsíquica (dinâmica entre a função psicológica principal, as auxiliares e a função inferior) e interpsíquica (dinâmica entre os tipos psicológicos dos cônjuges). O método consiste em um estudo de caso, tendo um casal como sujeito de pesquisa. Para pesquisar a dinâmica do casal, utilizamos três fontes de dados: os resultados das aplicações do QUATI (Questionário de Avaliação Tipológica), o relato da entrevista de cada cônjuge separadamente e a análise vivencial dos sujeitos durante as entrevistas. No nosso estudo de caso, entretanto, os resultados obtidos pelo QUATI não foram tipos opostos ideais. A nossa compreensão do caso é a de que, embora os cônjuges não sejam opostos tipológicos ideais, eles funcionam como opostos intrapsíquicos, uma vez que suas atitudes e funções utilizadas são complementares em muitas situações das diversas áreas da vida humana. Observamos também uma relação simbiótica, entretanto a projeção que um cônjuge faz ao outro não é de suas partes sombrias e sim de suas potencialidades latentes, de maneira que a relação torna-se criativa, apesar de conflitiva.