We engineered the cytochrome P450 monooxygenase CYP107D1 (OleP) from Streptomyces antibioticus for the stereo-and regioselective 7b-hydroxylation of lithocholic acid (LCA) to yield ursodeoxycholic acid (UDCA). OleP was previously shown to hydroxylate testosterone at the 7b-position but LCA is exclusively hydroxylated at the 6b-position, forming murideoxycholic acid (MDCA). Structural and 3DM analysis, and molecular docking were used to identify amino acid residues F84, S240, and V291 as specificitydetermining residues. Alanine scanning identified S240A as a UDCA-producing variant. A synthetic "small but smart" library based on these positions was screened using a colorimetric assay for UDCA. We identified a nearly perfectly regioand stereoselective triple mutant (F84Q/S240A/V291G) that produces 10-fold higher levels of UDCA than the S240A variant. This biocatalyst opens up new possibilities for the environmentally friendly synthesis of UDCA from the biological waste product LCA. Ursodeoxycholic acid (UDCA) is a valuable bile acid frequently prescribed for the treatment of cholecystitis as it can solubilize cholesterol gallstones with fewer side effects than chenodeoxycholic acid (CDCA). [1] UDCA also has anti-inflammatory properties [2] and is applied in the therapy of cystic fibrosis [3] and liver diseases like primary biliary cholangitis. [4] The major natural source of UDCA is bear bile, [5] a popular traditional medicine obtained by biliary catheterization of farmed bears. Alternatively, semi-synthetic UDCA can be produced from cholic acid (CA) [6] or CDCA. [7, 8] The synthesis route starting from CA forms CDCA within 5 steps, including a Wolff-Kishner reduction, and an epimerization at C7 to produce UDCA (Scheme 1 a, Scheme S1). [9] The yields of this pathway do not exceed 30 %. To overcome these limitations, a shorter synthesis route based on the biocatalytic epimerization of CDCA to UDCA (Scheme 1 a) has been developed. [7, 10] LCA is an abundant and inexpensive waste product of meat production [11] as this bile acid is found in farmed animals like sheep, [12] cattle, [12] and pigs. [13] Currently, no biotechnological process [14] utilizing LCA originating from these sources is known, making it a desirable starting material for the synthesis of UDCA. A few microbial organisms have been reported to form UDCA from LCA. [15] For example, the fungus Fusarium equiseti converts LCA to a number of products, including UDCA at 35 % yield. [16] However, there is currently no enzyme known to selectively hydroxylate LCA at the 7b-position to form UDCA and its synthesis pathway in microbial organisms, starting from LCA, remains enigmatic. An enzyme for direct 7b-hydroxylation would be a valuable tool for direct conversion of LCA to UDCA without involving the complex metabolism of fungi that invariably [16] produce multiple undesired side products, [15] complicating downstream processing. A major challenge in the enzymatic conversion of LCA to UDCA is the hydrophobicity and thus, extremely low water solubility of LCA co...

Objective Regio-and stereoselective hydroxylation of lithocholic acid (LCA) using CYP107D1 (OleP), a cytochrome P450 monooxygenase from the oleandomycin synthesis pathway of Streptomyces antibioticus. Results Co-expression of CYP107D1 from S. antibioticus and the reductase/ferredoxin system PdR/PdX from Pseudomonas putida was performed in Escherichia coli whole cells. In vivo hydroxylation of LCA exclusively yielded the 6b-OH product murideoxycholic acid (MDCA). In resting cells, 19.5% of LCA was converted to MDCA within 24 h, resulting in a space time yield of 0.04 mmol L-1 h-1. NMR spectroscopy confirmed the identity of MDCA as the sole product. Conclusions The multifunctional P450 monooxygenase CYP107D1 (OleP) can hydroxylate LCA, forming MDCA as the only product.

The CYP171 enzyme is known to catalyse a key step in the steroidogenesis of mammals. The substrates progesterone and pregnenolone are first hydroxylated at the C17 position, and this is followed by cleavage of the C17-C20 bond to yield important precursors for glucosteroids and androgens. In this study, we focused on the reaction of the bovine CYP17A1 enzyme with progesterone as a substrate. On the basis of a created homology model, active-site residues were identified and systematically mutated to alanine. In whole-cell biotransformations, the importance of the N202, R239, G297 and E305 residues for substrate conversion was confirmed. Additionally, mutation of the L206, V366 and V483 residues enhanced the formation of the 16α-hydroxyprogesterone side product up to 40 % of the total product formation. Furthermore, residue L105 was found not to be involved in this side activity, which contradicts a previous study with the human enzyme.

Wir haben die P450-Monooxygenase CYP107D1 (OleP) aus Streptomyces antibioticus für die stereo-und regioselektive 7b-Hydroxylierung von Lithocholsäure (LCS) zur Herstellung von Ursodeoxycholsäure (UDCS) durch "Protein-Engineering" angepasst. OleP wurde zuvor für die Hydroxylierung von Testosteron an der 7b-Position beschrieben, hydroxyliert jedoch LCS ausschließlich an der 6b-Position, wodurch Murideoxycholsäure (MDCS) gebildet wird. Strukturund 3DM-Analysen, sowie molekulare Modellierungen wurden verwendet, um die Aminosäurereste F84, S240 und V291 als spezifitätsbestimmend zu identifizieren. Durch einen Alaninscan wurde S240A als UDCS-produzierende Variante identifiziert. Basierend auf den identifizierten Positionen wurde eine synthetische "small but smart" Bibliothek durch die Verwendung eines farbbasierten Assays auf UDCS Produktion getestet. Hier konnte eine beinahe perfekte regio-und stereoselektive Dreifachvariante (F84Q/S240A/V291G) identifiziert werden, die UDCS in einer 10-fach hçheren Menge produziert als die S240A Variante. Der hergestellte Biokatalysator erçffnet neue Mçglichkeiten zur umweltfreundlichen Synthese von UDCS aus dem Abfallprodukt LCS. Ursodeoxycholsäure (UDCS) ist eine wertvolle Gallensäure, die häufig zur Behandlung von Cholezystitis verschrieben wird, da sie Cholesteringallensteine mit weniger Nebenwirkungen als Chenodeoxycholsäure (CDCS) auflçsen kann. [1] UDCS hat auch entzündungshemmende Eigenschaften [2] und wird in der Therapie zystischer Fibrosen [3] und Lebererkrankungen wie der primären biliären Zirrhose angewendet. [4] UDCS kommt in der Natur nur in Bärengalle [5] vor und findet Verwendung in der traditionellen Medizin, kann aber lediglich durch Gallenkatheterisierung von Zuchtbären gewonnen werden. Alternativ kann UDCS halbsynthetisch aus Chol-säure (CS) [6] oder CDCS hergestellt werden. [7, 8] Die von CS startende Syntheseroute führt zu CDCS innerhalb von 5 Schritten, einschließlich einer Wolff-Kishner-Reduktion, und bildet UDCS durch eine Epimerisierung an C7 (Schema 1 a, Schema S1). [9] Die Ausbeute dieser Syntheseroute übersteigt 30 % nicht. Um diese Limitierungen zu umgehen, wurden kürzere biokatalytische Synthesewege erschlossen, die Enzyme für die Epimerisierung von CDCS zu UDCS verwenden (Schema 1 a). [7, 10] LCS ist als Abfallprodukt der Fleischproduktion [11] reichlich und kostengünstig vorhanden, da LCS in Nutztieren wie Schafen, [12] Rindern [12] und Schweinen [13] vorkommt. Zurzeit ist kein biotechnologischer Prozess [14] bekannt, der UDCS aus LCS herstellt. Somit ist LCS als Substrat von Interesse. Bisher konnte die Produktion von UDCS aus LCS für wenige mikrobielle Organismen gezeigt werden. [15] Der Pilz Fusarium equiseti kann LCS zu einer Reihe von Produkten umsetzen; so auch zu UDCS mit einer Ausbeute von 35 %. [16] Derzeit ist kein Enzym bekannt, das LCS selektiv an der 7b-Position hydroxyliert und UDCS bildet. Der Syntheseweg zu UDCS in Mikroorganismen ist, ausgehend von LCS, unaufgeklärt. Ein Enzym zur direkten 7b-Hydroxylierung wäre ein wertvolles Werkze...