DM modestly affects the NPY system in the retina and these effects are not prevented by sitagliptin treatment. These observations suggest that DPP-IV enzyme is not underlying the NPY changes detected in the retina induced by type 1 DM.
MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of several plant developmental processes including embryogenesis. Most miRNA families are conserved across major groups of plant species, but their regulatory roles have been studied mainly in model species like Arabidopsis and other angiosperms. In gymnosperms, miRNA-dependent regulation has been less studied since functional approaches in these species are often difficult to establish. Given the fundamental roles of auxin signaling in somatic embryogenesis (SE) induction and embryo development, we investigated a previously predicted interaction between miR160 and a putative target encoding AUXIN RESPONSE FACTOR 18 in Pinus pinaster (PpARF18) embryonic tissues. Phylogenetic analysis of AUXIN RESPONSE FACTOR 18 (ARF18) from Pinus pinaster and Picea abies, used here as a model system of conifer embryogenesis, showed their close relatedness to AUXIN RESPONSE FACTOR (ARF) genes known to be targeted by miR160 in other species, including Arabidopsis ARF10 and ARF16. By using a luciferase (LUC) reporter system for miRNA activity in Arabidopsis protoplasts, we have confirmed that P. pinaster miR160 (ppi-miR160) interacts in vivo with PpARF18 target site. When the primary miR160 from P. pinaster was overexpressed in protoplasts under non-limiting levels of ARGONAUTE1, a significant increase of miR160 target cleavage activity was observed. In contrast, co-expression of the primary miRNA and the target mimic MIM160 led to a decrease of miR160 activity. Our results further support that this interaction is functional during consecutive stages of SE in the conifer model P. abies. Expression analyses conducted in five stages of development, from proembryogenic masses (PEMs) to the mature embryo, show that conifer ARF18 is negatively regulated by miR160 toward the fully developed mature embryo when miR160 reached its highest expression level. This study reports the first in vivo validation of a predicted target site of a conifer miRNA supporting the conservation of miR160 interaction with ARF targets in gymnosperms. The approach used here should be useful for future characterization of miRNA functions in conifer embryogenesis.
O avanço nas tecnologias de sequenciação e caracterização do RNA tem permitido revelar mecanismos essenciais na biologia dos organismos até recentemente desconhecidos.O transcritoma das células engloba uma grande diversidade de formas de RNA, que se agrupam em RNA codificante e não codificante. O primeiro é o RNA mensageiro (mRNA) que tem como função servir de modelo para a síntese de proteínas na célula. Por sua vez, o RNA não codificante, constitui 98% do transcritoma e inclui não só o RNA de transferência (tRNA) e o RNA ribossomal (rRNA), essenciais na tradução, mas também os RNAs nucleolares (snoRNAs), Vault RNAs (vRNAs), PIWI-interacting RNAs (piRNAs) e ainda os pequenos RNAs (sRNAs), onde se incluem várias formas de RNAs de interferência (siRNAs) e microRNAs (miRNAs).Os microRNAs são das mais pequenas moléculas de RNA não codificante, sendo constituídos apenas por 20-24 nucleótidos. Foram descobertos em 1993 em estudos no nemátode Caenorhabditis elegans, aquando da análise dos genes lin-14 e lin-4, envolvidos no desenvolvimento deste organismo modelo 1 . Nas plantas, o primeiro miRNA foi identificado em Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. 2 e até à data foram já identificadas mais de cerca de 8500 destas moléculas em mais de 70 espécies. A expressão dos miRNAs é altamente dependente do tipo de tecido e, por isso, os seus padrões e timings de expressão variam ao longo do desenvolvimento. Estão envolvidos no controlo da expressão genética, atuando pós--transcricionalmente. Por exemplo, em mamíferos, a expressão de 60% dos genes codificantes de proteínas é regulada por miRNAs 3 . Muitos miRNAs pertencem a famílias cujas sequências são muito similares entre os membros, variando apenas num único nucleótido.Por sua vez, cada miRNA atua em vários mRNAs-alvo, sendo que nas plantas os miRNAs têm, em geral, menos genes-alvo que os animais. Além disso, cada mRNA é alvo da ação de diferentes miRNAs, resultando assim numa complexa rede de regulação 4,5 . Os miRNAs são codificados pelos genes MIRNAs (MIR), muitos dos quais bastante conservados no Reino Vegetal 6 . Transcritos pela RNA POLIMERASE II, os transcritos MIR de cadeia simples, dobram-se sobre si mesmos emparelhando e formando uma estrutura semelhante a um gancho de cabelo (harpin ou stem-loop), passando assim a designar-se miRNAs primários (pri-miRNAs) 7 . Nas plantas, os pri-miRNAs são clivados pela ação da RNase DICER-LIKE 1 (DCL1), daí resultando pequenas porções de RNA de cadeia dupla, os precursores dos miRNAs (pre-miRNAs). Estes sofrem depois metilação nas extremidades 3' pela ação da RNA metiltransferase HUA ENHANCER 1 (HEN1), tornando-se maduros e, consequentemente, saem do núcleo através de uma proteína homóloga da exportina, designada HASTY 8 . Uma vez no citoplasma, ligam-se à proteína ARGONAUTE 1 (AGO1) e, em conjunto com outras proteínas, formam o complexo de silenciamento induzido por RNA CITAÇÃO
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