Streptococcus pneumoniae is the main cause of pneumonia, meningitis, and other conditions that kill thousands of children every year worldwide. The replacement of pneumococcal serotypes among the vaccinated population has evidenced the need for new vaccines with broader coverage and driven the research for protein-based vaccines. Pneumococcal surface protein A (PspA) protects S. pneumoniae from the bactericidal effect of human apolactoferrin and prevents complement deposition. Several studies indicate that PspA is a very promising target for novel vaccine formulations. Here we describe a production and purification process for an untagged recombinant fragment of PspA from clade 4 (PspA4Pro), which has been shown to be cross-reactive with several PspA variants. PspA4Pro was obtained using lactose as inducer in Phytone auto-induction batch or glycerol limited fed-batch in 5-L bioreactor. The purification process includes two novel steps: (i) clarification using a cationic detergent to precipitate contaminant proteins, nucleic acids, and other negatively charged molecules as the lipopolysaccharide, which is the major endotoxin; and (ii) cryoprecipitation that eliminates aggregates and contaminants, which precipitate at -20 °C and pH 4.0, leaving PspA4Pro in the supernatant. The final process consisted of cell rupture in a continuous high-pressure homogenizer, clarification, anion exchange chromatography, cryoprecipitation, and cation exchange chromatography. This process avoided costly tag removal steps and recovered 35.3 ± 2.5% of PspA4Pro with 97.8 ± 0.36% purity and reduced endotoxin concentration by >99.9%. Circular dichroism and lactoferrin binding assay showed that PspA4Pro secondary structure and biological activity were preserved after purification and remained stable in a wide range of temperatures and pH values.
-The main virulence factor of Streptococcus pneumoniae is the capsular polysaccharide (PS), which is the antigen of all current vaccines that are prepared with PS purified from serotypes prevalent in the population. In this work, three purification strategies were evaluated and a new process was developed for purification of serotype 14 PS (PS14), responsible for 39.8% of diseases in children of 0-6 years old in Brazil. The developed method consists of cell separation by tangential microfiltration, concentration of the microfiltrate by tangential ultrafiltration (50 kDa), diafiltration in the presence of sodium dodecyl sulfate using a 30 kDa ultrafiltration membrane, precipitation with 5% trichloroacetic acid, precipitation with 20% and 60% ethanol, and anion exchange chromatography. The required purity regarding nucleic acids (≤ 2%) and proteins (≤ 3%) was achieved, resulting in a relative purity of 439 mg PS14/mg nucleic acids and 146 mg PS14/mg proteins. The final polysaccharide recovery was 65%, which is higher than the recovery of the majority of processes described in the literature.
buscam-se vacinas alternativas mais eficazes. Neste trabalho desenvolveu-se um processo escalonável de purificação do fragmento recombinante da PspA do clado 4 para uso em uma nova vacina, que consistiu das etapas: ruptura celular em homogeneizador contínuo de alta pressão, precipitação com detergente CTAB, clarificação, cromatografia de troca aniônica, crioprecipitação a pH4,0 e cromatografia de troca catiônica. PspA4Pro foi obtida com pureza >97% e recuperação de 30%. A eliminação final do lipopolissacarídeo (contaminante que causa febre) foi feita em resina de polilisina. Espectros de dicroísmo circular mostraram estrutura secundária correta da PspA4Pro purificada, bem como estabilidade térmica e a variações de pH. A atividade de PspA4Pro foi confirmada em ensaio de ligação à lactoferrina. Portanto, o processo é adequado à obtenção de PspA4Pro com as características requeridas para uso humano.
RESUMO -O principal fator de virulência do S. pneumoniae é o polissacarídeo (PS) capsular, antígeno das vacinas atuais elaboradas com PS purificados de sorotipos prevalentes na população. Neste trabalho foi desenvolvido um processo de purificação escalonável do PS do sorotipo 14, responsável por 39% das doenças em crianças de 0-6 anos no Brasil. Após separação celular por microfiltração tangencial, o caldo contendo PS foi concentrado por ultrafiltração tangencial (50 kDa). Além das já descritas precipitações alcoólicas 20% e 60%, 2 novas estratégias foram testadas para remoção contaminantes: precipitação com ácido tricloroacético (TCA) e diafiltração em presença do detergente docecil sulfato de sódio (SDS) para facilitar o escape de contaminantes no ultrafiltrado. TCA e SDS foram eficientes, sobretudo para eliminação de proteínas e SDS aumentou a eficiência das precipitações alcoólicas. A pureza requerida foi atingida com a combinação de SDS, TCA e precipitações alcoólicas e a recuperação global de PS ficou em 50%.
INTRODUÇÃOS. pneumoniae ou "pneumococo" é uma bactéria Gram-positiva, encapsulada, disposta aos pares (diplococos) ou em cadeias curtas, nutricionalmente fastidiosa e de metabolismo anaeróbio aerotolerante (Cartwright, et al 1994). S. pneumoniae é um patógeno exclusivamente humano, encontrado normalmente na microbiota da nasofaringe e responsável por infecções das vias respiratórias superiores e inferiores, que podem ser moderadas (otite, sinusite, bronquite e pneumonia) ou graves (pneumonia necrotizante, meningite, bacteremia e septicemia), levando muitas vezes os pacientes a óbito (Bricks; Berezin, 2006).A cápsula polissacarídica forma a estrutura externa do pneumococo, é capaz de inibir a fagocitose e o principal fator de virulência deste microrganismo, uma vez que cepas sem cápsula são fagocitadas e não causam doenças. Outra propriedade da cápsula é estimular a produção de anticorpos que podem ser utilizados para classificar o pneumococo em sorotipos. Sabe-se que cada sorotipo corresponde a uma estrutura química diferente do polissacarídeo (PS) da cápsula e Área temática: Processos Biotecnológicos 1
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