One often-cited weakness of biocatalysis is the lack of mirror-image enzymes for the formation of either enantiomer of a product in asymmetric synthesis. Enantiocomplementary enzymes exist as the solution to this problem in nature. These enzyme pairs, which catalyze the same reaction but favor opposite enantiomers, are not mirror-image molecules; however, they contain active sites that are functionally mirror images of one another. To create mirror-image active sites, nature can change the location of the binding site and/or the location of key catalytic groups. In this Minireview, X-ray crystal structures of enantiocomplementary enzymes are surveyed and classified into four groups according to how the mirror-image active sites are formed.

The Golden Gate strategy entails the use of type IIS restriction enzymes, which cut outside of their recognition sequence. It enables unrestricted design of unique DNA fragments that can be readily and seamlessly recombined. Successfully employed in other synthetic biology applications, we demonstrate its advantageous use to engineer a biocatalyst. Hot-spots for mutations were individuated in three distinct regions of Candida antarctica lipase A (Cal-A), the biocatalyst chosen as a target to demonstrate the versatility of this recombination method. The three corresponding gene segments were subjected to the most appropriate method of mutagenesis (targeted or random). Their straightforward reassembly allowed combining products of different mutagenesis methods in a single round for rapid production of a series of diverse libraries, thus facilitating directed evolution. Screening to improve discrimination of short-chain versus long-chain fatty acid substrates was aided by development of a general, automated method for visual discrimination of the hydrolysis of varied substrates by whole cells.

The regio-isomeric distribution of the omega-3 polyunsaturated fatty acids (PUFA) 8,11,14,7,10,13,16, in the triacylglycerols (TAG) of anchovy/sardine fish oil was determined by 13 C nuclear magnetic resonance (NMR) analysis under quantitative conditions. From the measurements of sn-1,3 and sn-2 carbonyl peak areas it was established that EPA was mainly located in the sn-1,3 positions, whereas DHA primarily occupied the sn-2 position. Reconstituted TAG prepared by Candida antarctica lipase-B (CALB) glycerolysis of the ethyl ester (EE) or the free fatty acid (FFA) forms of anchovy/sardine fish oil, displayed a different pattern: EPA was equally distributed, while DHA was preferentially attached to the sn-1,3 positions. TAG concentrates of varying EPA and DHA molar fractions were prepared by CALB-catalyzed glycerolysis of the corresponding EE and FFA. 13 C-NMR analysis of the purified products revealed a lack of CALB regioselectivity for EPA and a slight sn-1,3 regioselectivity for DHA. Since this pattern was observed in all cases of this study, it was concluded that the lipase regioselectivity during TAG synthesis is independent of both the acyl donor type (carboxylic acid or ester) and the fatty acid content of the oil substrate.

EinführungReine Enantiomere werden entweder über eine Racematspaltung oder eine asymmetrische Synthese hergestellt. Bei der Racematspaltung erhält man beide Enantiomere, allerdings mit einer theoretischen Ausbeute von nur 50 %, asymmetrische Synthesen ergeben nur ein Enantiomer mit einer theoretischen Ausbeute von 100 %. Diese hö-here theoretische Ausbeute kann die Kosten senken und die Umweltbelastung reduzieren.Eine Schwäche der asymmetrischen Synthese ist die Wahrscheinlichkeit von 50 %, dass das resultierende Enantiomer das falsche ist. Sind chemische Reagentien oder Katalysatoren beteiligt, ist die Lösung einfach: Man setzt das Reagens oder den Katalysator in der richtigen enantiomeren Form ein, um das gewünschte Enantiomer herzustellen. In der Biokatalyse ist diese Vorgehensweise nicht möglich -enantiomere Biokatalysatoren kommen in der Natur nicht vor. Diese Einschränkung wird oft als ein schwerwiegender Nachteil der Biokatalyse angeführt.Zwar kommen enantiomere Biokatalysatoren in der Natur nicht vor, dieser Kurzaufsatz zeigt aber, dass enantiokomplementäre Biokatalysatoren überraschend häufig sind. Enantiokomplementäre Biokatalysatoren haben funktionell spiegelbildliche aktive Zentren und katalysieren die gleichen Reaktionen, es werden aber entgegengesetzte Enantiomere gebildet. Solche enantiokomplementären Biokatalysatoren heben die Einschränkung auf, die durch das Fehlen von spiegelbildlichen Biokatalysatoren entsteht.Ein weiterer Grund zur Untersuchung von enantiokomplementären Enzymen ist die Aufklärung der molekularen Grundlagen der Katalyse. Enantiokomplementäre Enzyme katalysieren die gleichen Reaktionen, haben aber mögli-cherweise unterschiedliche Proteinstrukturen und/oder verEine häufig zitierte Schwäche der Biokatalyse ist das Fehlen spiegelbildlicher Enzyme, um in asymmetrischen Synthesen jedes der beiden Enantiomere herstellen zu können. Als Lösung für dieses Problem hat die Natur enantiokomplementäre Enzyme entwickeltalso Enzympaare, die dieselben Reaktionen katalysieren, aber entgegengesetzte Enantiomere bevorzugen. Diese Proteine sind nicht spiegelbildlich, aber sie enthalten funktionell spiegelbildliche aktive Zentren. Um spiegelbildliche aktive Zentren zu erhalten, kann die Natur die Position der Bindungsstellen und/oder der wichtigsten katalytischen Gruppen verändern. Dieser Kurzaufsatz stellt Röntgen-kristallstrukturen von enantiokomplementären Enzymen vor und klassifiziert diese nach der Anordnung der spiegelbildlichen aktiven Zentren in vier Gruppen.[