Summary
Protein-protein interactions (PPIs) are of fundamental importance for our understanding of physiology and pathology. PPIs involving short, linear motifs play a major role in immunological recognition, signaling, and regulation and provide attractive starting points for pharmaceutical intervention. Yet, state-of-the-art protein-peptide affinity determination approaches exhibit limited throughput and sensitivity, often resulting from ligand immobilization, labeling, or synthesis. Here, we introduce a high-throughput method for in-solution analysis of protein-peptide interactions using a phenomenon called temperature related intensity change (TRIC). We use TRIC for the identification and fine-mapping of low- and high-affinity protein interaction sites and the definition of sequence binding requirements. Validation is achieved by microarray-based studies using wild-type and mutated recombinant protein and the native protein within tissue lysates. On-chip neutralization and strong correlation with structural data establish TRIC as a quasi-label-free method to determine binding affinities of unmodified peptide libraries with large dynamic range.
Visualization of inhibitory synapses requires protocol tailoring for different sample types and imaging techniques, and usually relies on genetic manipulation or the use of antibodies that underperform in tissue immunofluorescence. Starting from an endogenous ligand of gephyrin, a universal marker of the inhibitory synapse, we developed a short peptidic binder and dimerized it, significantly increasing affinity and selectivity. We further tailored fluorophores to the binder, yielding "Sylite"-a probe with outstanding signal-tobackground ratio that outperforms antibodies in tissue staining with rapid and efficient penetration, mitigation of staining artifacts, and simplified handling. In superresolution microscopy Sylite precisely localizes the inhibitory synapse and enables nanoscale measurements. Sylite profiles inhibitory inputs and synapse sizes of excitatory and inhibitory neurons in the midbrain and combined with complimentary tracing techniques reveals the synaptic connectivity.
Die Visualisierung von inhibitorischen Synapsen erfordert auf Sondentypen und das jeweilige bildgebende Verfahren abgestimmte Protokolle und beruht in der Regel auf genetischer Manipulation oder der Verwendung von Antikörpern, die bei Gewebefärbungen unter ihrer geringen Eindringtiefe leiden. Abgestimmt auf das Gephyrin Protein, einem universellen Marker der inhibitorischen Synapse, haben wir eine kompakte, hochaffine und hochselektive peptid‐basierte Sonde entwickelt. Durch Anpassung der multivalenten Architektur und des Farbstoffs haben wir “Sylites” erhalten; eine Sonde die Färbungen mit hervorragendem Signal‐zu‐Hintergrund‐Verhältnis ermöglicht, und die Antikörper bei der Anwendung im Gewebe aufgrund von schneller und effizienter Penetration, Minderung von Färbeartefakten und vereinfachter Handhabung deutlich übertrifft. In hochauflösenden Mikroskopieverfahren lokalisiert Sylite präzise die hemmende Synapse und ermöglicht so Messungen im Nanometermaßstab. Darüber hinaus zeigen wir, dass Sylite mit viralen Färbemethoden kombinierbar ist und dass auf diese Weise nicht nur die synaptische Konnektivität, sondern auch die Identität und Größe der hemmenden Postsynapsen aufgelöst werden kann.
Sylite , eine kurze, dimerisierte Fluoreszenzsonde auf Peptidbasis, bindet Gephyrin, ein charakteristisches Protein der inhibitorischen Synapse. Wie Christian G. Specht, Hans M. Maric et al. in ihrem Forschungsartikel (e202202078) berichten, macht Sylite inhibitorische Synapsen in Neuronenkulturen und in Hirngewebe sichtbar und kann flexibel für die Weitfeld‐ und konfokale 3D‐Darstellung von Synapsen, für die Kartierung inhibitorischer Schaltkreise in Hirngewebe und für die superauflösende Bildgebung von Synapsen eingesetzt werden. Das Titelbild zeigt ein stilisiertes Bild eines Mäusehippocampus im Koronalschnitt, gefärbt mit Sylite in grün und DAPI‐Kernfärbung in blau. Grafik: Christian Günther
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