2013Dedico este trabalho às pessoas mais importantes da minha vida: meus pais, Paulo e Beth, que confiaram no meu potencial para esta conquista.Não conquistaria nada se não estivessem ao meu lado.Obrigada, por estarem sempre presentes a todos os momentos, me dando carinho, apoio, incentivo, determinação, fé, e principalmente pelo Amor de vocês! AgradecimentosAgradeço principalmente à Deus, por ter me dado a vida e estar sempre do meu lado, permitindo que com o passar do tempo eu possa evoluir principalmente como ser humano.Aos meus pais, Paulo e Beth, por dedicarem a vida por mim, por fazer de mim quem sou hoje, e pelo amor incondicional que sempre me fez seguir no caminho que escolhi.Ao meu irmão Diego e a minha tia Eliane, mesmo que de longe, participaram de mais esta conquista e tenho certeza que torceram todos os dias pelo meu sucesso. Muito Obrigada, Amo vocês!! Ao Bruno, pelo apoio em tudo que faço, pela dedicação, paciência e amor durante todos esses anos.À minha orientadora Ligia Ely Morganti Ferreira Dias, pela oportunidade de ser sua aluna, pela confiança depositada em mim e por compartilhar comigo seus conhecimentos e experiências profissionais.Ao Prof. Dr. Patrick Jack Spencer, por toda a ajuda e conselhos na realização deste trabalho e por dividir comigo seus conhecimentos e experiências no laboratório durante todos esses anos.Ao Dr. Carlos Bonafé, pela colaboração permitindo a utilização do sistema de pressão do Laboratório Termodinâmica de Protreínas da UNICAMP e a Juliana e Joelma pela ajuda na realização dos experimentos.Ao Dr. Geraldo Santana Magalhães, pela doação do gene da eGFP.Ao Dr. Shaker Chuck Farah, a Cristiane Guzzo, ao Maicon e ao Raphael pela doação dos genes das proteínas de Xac e pela ajuda na realização dos experimentos de purificação e atividade biológica destas proteínas. ESTUDOS DE RENATURAÇÃO DE PROTEÍNAS AGREGADAS UTILIZANDO ALTAS PRESSÕES HIDROSTÁTICAS NATÁLIA MALAVASI VALLEJO RESUMONo presente trabalho estudamos a renaturação sob alta pressão hidrostática de uma forma mutante da proteína verde fluorescente (enhanced GFP, eGFP), a qual somente emite fluorescência característica quando enovelada na sua forma nativa. A abordagem do presente estudo foi focada no controle da bioatividade da proteína recombinante, a fluorescência, como alternativa à determinação de solubilidade da proteína, fator que não é um indicador ideal de enovelamento proteico adequado. A ação da alta pressão na solubilização dos corpos de inclusão (CI) de eGFP produzidos em bactérias E. coli recombinantes e no enovelamento da proteína foi estudada. A compressão dos CI de eGFP em 2,4 kbar durante 30 minutos promoveu a dissociação dos agregados. No entanto, a incubação nesta condição não favoreceu o enovelamento da eGFP. O processo de renaturação foi avaliado em diversas condições de descompressão após a dissociação em 2,4 kbar. Durante a descompressão gradual, o aumento da fluorescência foi obtido em pressões que variaram entre a pressão atmosférica e 1,38kbar. Os níveis mais elevados de fluorescência de e...
Aggregation is a serious obstacle to recovery of biologically active proteins from inclusion bodies (IBs) produced by E. coli. High hydrostatic pressure was described as an interesting tool to solubilize and refold aggregated proteins. In order to obtain the refolding of aggregated and insoluble protein, cruzain IBs were subjected to compression (2 kbar) for 16 h and the effects of changes in ratio and concentration of oxido‐shuffling reagents and concentration of guanidine hydrochlorid were assayed. A 50% yield in refolding of the native cruzain was obtained using optimal conditions of the refolding buffer (Tris‐HCl buffer, pH 8.0, 0.75 M Gdn‐HCl, 2 mM EDTA). Additives in the refolding buffer did not further improve cruzain refolding yields. The presence of Bis‐ANS, a hydrophobic extrinsic fluorescent dye, which has been previously described to be able to suppress protein aggregation, surprisingly abolished completely cruzain refolding. The refolded cruzain presents enzymatic activity hydrolyzing a specific substrate (Z‐FR‐MCA). We demonstrated that high pressure can successfully refold cruzain with biological activity from insoluble aggregates in inclusion bodies.
AGRADECIMENTOSAgradeço primeiramente a Deus pela proteção e força para trilhar os caminhos da vida. Aos meus pais, Paulo e Elisabeth, pelo total apoio, confiança, dedicação durante todo esse tempo e por partilharem comigo os melhores momentos da minha vida. Ao meu irmão Diego, por estar do meu lado sempre e me chamar de doida por mexer com camundongos. Muito obrigada por ser meu irmão, e por participar de todas as minhas conquistas!!!! À minha orientadora Dra. Ligia Ely Morganti Ferreira Dias, pela orientação, confiança e por compartilhar comigo seus conhecimentos e experiências profissionais. Ao meu noivo Bruno, pelo amor, apoio, paciência e muita compreensão durante todos esses anos. Às Dras. Olga Zazuco Higa, Maria Aparecida Pires Camilo, Nanci do Nascimento e ao Dr. Patrick Jack Spencer, obrigada pela ajuda e disponibilização de reagentes e aparelhos. Ao Dr. Roger Chammas, da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, pela ajuda na realização das lâminas de imuno-histoquímica e disponibilização do laboratório de microscopia. Às amigas e irmãs, Flavinha, Claudinha e Renata, que sempre me acolheram na república das graçinhas e dividimos momentos inesquecíveis de faculdade e de república. Muuuuito obrigada pela amizade!!!! Às amigas Giovanna, Taís, Gabi e Thalita, agradeço pela amizade e momentos inesquecíveis que vivemos durante a faculdade e sei que mesmo longe algumas vezes, sempre torceram pelo meu sucesso. Muito Obrigada!!! À amiga Bianca, pelo apoio, conselhos e muitas e muitas horas de conversas sem fim que sempre tivemos. Agradeço pela amizade destes 11 anos inesquecíveis de nossas vidas. Às amigas, Rosa e Dani, obrigada pela ajuda desses anos, por estarem sempre por perto e pela amizade. Aos amigos, Keli e Bruno, obrigada pela amizade!!!! Aos amigos Janaína, Murilo, Alberto (Troxa) e Camila, obrigada pela ajuda de todos esses anos e pela amizade. À Neidinha, que sempre esteve disposta a ajudar na sangria de todos os meus animais, e pelos vários momentos de risada e desabafo. Muito Obrigada pela ajuda!!! Aos funcionários e amigos Johnny, Junqueira e Zé Maria, que sempre estiveram dispostos a ajudar em tudo. A todos os funcionários e amigos do IPEN, Dona Ge, Edu, Longino pela manutenção e organização dos laboratórios. À FAPESP pela concessão dos recursos financeiros para realização deste projeto (Auxílio à Pesquisa Processo nº 00/04658-0). Ao CNPq pelo apoio financeiro.
scite is a Brooklyn-based organization that helps researchers better discover and understand research articles through Smart Citations–citations that display the context of the citation and describe whether the article provides supporting or contrasting evidence. scite is used by students and researchers from around the world and is funded in part by the National Science Foundation and the National Institute on Drug Abuse of the National Institutes of Health.
hi@scite.ai
10624 S. Eastern Ave., Ste. A-614
Henderson, NV 89052, USA
Copyright © 2024 scite LLC. All rights reserved.
Made with 💙 for researchers
Part of the Research Solutions Family.