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Drug discovery is a multifaceted endeavor encompassing as its core element the generation of structure-activity relationship (SAR) data by repeated chemical synthesis and biological testing of tailored molecules. Herein, we report on the development of a flow-based biochemical assay and its seamless integration into a fully automated system comprising flow chemical synthesis, purification and in-line quantification of compound concentration. This novel synthesis-screening platform enables to obtain SAR data on b-secretase (BACE1) inhibitors at an unprecedented cycle time of only 1 h instead of several days. Full integration and automation of industrial processes have always led to productivity gains and cost reductions, and this work demonstrates how applying these concepts to SAR generation may lead to a more efficient drug discovery process.

Cellular signaling is classically investigated by measuring optical or electrical properties of single or populations of living cells. Here we show that ligand binding to cell surface receptors and subsequent activation of signaling cascades can be monitored in single, (sub-)micrometer sized native vesicles with single-molecule sensitivity. The vesicles are derived from live mammalian cells using chemicals or optical tweezers. They comprise parts of a cell’s plasma membrane and cytosol and represent the smallest autonomous containers performing cellular signaling reactions thus functioning like minimized cells. Using fluorescence microscopies, we measured in individual vesicles the different steps of G-protein-coupled receptor mediated signaling like ligand binding to receptors, subsequent G-protein activation and finally arrestin translocation indicating receptor deactivation. Observing cellular signaling reactions in individual vesicles opens the door for downscaling bioanalysis of cellular functions to the attoliter range, multiplexing single cell analysis, and investigating receptor mediated signaling in multiarray format.

Phototransformations of autofluorescent proteins are applied in high-resolution microscopy and in studying cellular transport, but they are detrimental when accidentally occurring in blinking or photobleaching (BL). Here, we investigate the kinetics of phototransformations of a photoactivatable green fluorescent protein (GFP) in confocal microscopy. Photoconversion (PC) is achieved by excitation of the barely present anionic chromophore state R(eq) (-) in the GFP mutant Thr203Val. Besides the shift of the equilibrium between the neutral chromophore state RH and R(eq) (-), the photoconverted anionic chromophore R(PC) (-) exhibits a reduced fluorescence lifetime tau(fl)=2.2 ns. In fluorescence lifetime imaging microscopy, tau(fl) is found to depend, however, on the excitation conditions and history. The underlying photochemistry is described by the kinetic scheme of consecutive reactions, R(eq) (-)-->R(PC) (-)-->P(dark), in which the anionic chromophore species and the dark protein P(dark) are coupled by PC and BL. Time-correlated single-photon-counting detection in a confocal geometry of freely diffusing species is used to compute the quantum yields for PC and BL, Phi(PC) and Phi(BL). The assessed values are Phi(PC)=5.5 x 10(-4) and Phi(BL)>1 x 10(-5). Based on these values, PC provokes misinterpretation in fluorescence resonance energy transfer experiments and is responsible for spectroscopic peculiarities in single-molecule detection.

A micrometer-sized affinity bead (red) is (i) taken up into a cell by phagocytosis, (ii) photochemically released from phagosomes, (iii) optically trapped by the cell, and (iv) isolated by cell lysis for subsequent analysis of captured intracellular analyte (green).

Die Arzneistoffentwicklung stellt ein vielfältiges Aufgabenfeld dar, welches als grundlegendes Element die Erzeugung von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen (SAR) durch wiederholte chemische Synthese und biologische Aktivitätsbestimmung maßgeschneiderter Moleküle beinhaltet. Hier berichten wir über die Entwicklung eines Fluss-basierten biochemischen Assays und seine nahtlose Einbindung in ein vollautomatisiertes System, bestehend aus flusschemischer Synthese, Aufreinigung und Quantifizierung in serieller Abfolge. Diese neuartige Synthese-Screening-Platform ermçglicht es, SAR-Daten von b-Sekretase-Hemmern in einer bisher unerreichten Durchlaufzeit von 1 Stunde anstelle mehrerer Tage zu erhalten. Die vollständige Automatisierung und Einbindung industrielle Prozesse hat seit jeher zu Produktivitätssteigerung und Kosteneinsparungen geführt. Diese Studie zeigt, wie diese Konzepte angewandt auf die Erzeugung von SAR-Daten, zu einem effizienteren Arzneistoffentwicklungsprozess führen kçnnen.Das Auffinden von Leitstrukturen mittels iterativer Erzeugung von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen (SAR) ist grundlegendes Element der frühen Arzneistoffentwicklung. [1] Ein vollständiger SAR-Durchlauf setzt sich aus der organischen Synthese des Wirkstoffs, seiner Aufreinigung sowie dessen Strukturnachweis und biologischer Aktivitätsbestimmung samt Datenauswertung zusammen. Dabei werden die verschiedenen Aufgaben zur Generierung von SAR-Daten üblicherweise in hochspezialisierten und räumlich getrennten Einrichtungen durchgeführt, was eine zeitaufwendige Logis-tik und zahlreiche Transportschritte der synthetisierten Verbindungen bedingt. Ein weit verbreiteter Lçsungansatz für dieses Problem besteht in der Parallelisierung von chemischer Synthese und biologischem Assay, was jedoch aufgrund des Fehlens von Rückkopplungsinformationen in Echtzeit ein eher kostspieliges Konzept darstellt, da eine Vielzahl irrelevanter chemischer Strukturen erzeugt werden. [2] Es ist daher von großem Vorteil, die gesamten chemischen, analytischen und biologischen Arbeitsschritte in einem einzigen, kontinuierlichen Prozess zusammenzuführen, was zeitliche sowie räumliche Barrieren verrringern und somit eine kosteneffizientere Identifizierung von Leitstrukturen ermçglichen würde. [3] Die hier vorliegende Studie hat daher zum Ziel, einen biologischen Assay zu entwickeln, der direkt in einen fluidischen Prozess eingebunden werden kann, um diesen schließlich nahtlos in ein vollautomatisiertes System zur Synthese, Aufreinigung und Quantifizierung von Wirkstoffen unter Durchflussbedingungen in serieller Abfolge zu integrieren. Diese vollintegrierte Synthese-Screening-Plattform ermçglicht es, SAR-Daten innerhalb von 60 Minuten, gerechnet ab dem Zeitpunkt der Injektion der Startmaterialien bis hin zur Erzeugung der mittleren inhibitorischen Konzentration (IC 50 ), gegen ein bestimmtes Zielprotein zu generieren. Die Validierung unseres Ansatzes erfolgte über die Erzeugung von SAR-Daten für zwei verschiedene Anilin-Bausteine, welche mit ausgewählten Carbonsäuren gekuppelt w...