The recently described fish species, Astyanax altiparanae (tetra) is common in the upper rio Paraná basin, and has been reported in the Iguaçu basin. However, its natural origin in the rio Iguaçu is questionable. In the present work, karyotypical and morphological features of two populations of Astyanax altiparanae from the upper rio Tibagi and upper rio Iguaçu were compared. Both populations showed 2n=50 chromosomes and differences in their karyotype formula, NOR-bearing chromosomes and location of heterochromatin. Morphometric data from both populations were analyzed through free-size canonical variables. Cytogenetic and morphological results were mostly coincident showing exclusive markers that reflect their degree of populational isolation. In addition to other geographic, morphological and molecular data for A. altiparanae populations from the lower rio Iguaçu and rio Paraná tributaries upstream from the Itaipu Dam (South Brazil), the present results indicate that the two populations analyzed in this study belong to different stocks. The presence of this species along the rio Iguaçu basin would be a consequence of a complex and poorly understood evolutionary history.Astyanax altiparanae, recentemente descrita, é comum na bacia do alto rio Paraná, tendo sido registrada recentemente na bacia do rio Iguaçu. Entretanto, sua origem natural no rio Iguaçu é questionável. No presente trabalho algumas características cariotípicas e morfológicas de duas populações de Astyanax altiparanae do rio alto rio Tibagi e alto rio Iguaçu foram comparadas. Ambas as populações mostraram 2n=50 cromossomos e diferenças nas suas fórmulas de cariotípicas, cromossomos portadores das regiões organizadoras de nucléolos e localização da heterocromatina. Dados morfométricos das duas populações foram analisados para variáveis canônicas livres de tamanho. Os dados citogenéticos e morfológicos foram coincidentes e mostraram marcas exclusivas que refletem o grau de isolamento populacional. Em adição a outros dados geográficos, morfológicos e moleculares em populações de A. altiparanae do baixo rio Iguaçu e tributários do rio Paraná acima da represa de Itaipu (Sul do Brasil), os presentes resultados indicam que as duas populações analisadas neste estudo pertençam a diferentes estoques. A presença desta espécie ao longo da bacia do rio Iguaçu pode ser uma conseqüência de uma história evolutiva complexa e pouco conhecida.