Regulators of G-protein signaling (RGS) 9-2 is a striatal enriched protein that controls G protein coupled receptor signaling duration by accelerating Ga subunit guanosine triphosphate hydrolysis. We have previously demonstrated that mice lacking the RGS9 gene show enhanced morphine analgesia and delayed development of tolerance. Here we extend these studies to understand the mechanism via which RGS9-2 modulates opiate actions. Our data suggest that RGS9-2 prevents several events triggered by mu-opioid receptor (MOR) activation. In transiently transfected PC12 cells, RGS9-2 delays agonist induced internalization of epitope HA-tagged l-opioid receptor. This action of RGS9-2 requires localization of the protein near the cell membrane.Co-immunoprecipitation studies reveal that RGS9-2 interacts with HA-tagged l-opioid receptor, and that this interaction is enhanced by morphine treatment. In addition, morphine promotes the association of RGS9-2 with another essential component of MOR desensitization, b-arrestin-2. We also show that over-expression of RGS9-2 prevents opiateinduced extracellular signal-regulated kinase phosphorylation. Our data indicate that RGS9-2 plays an essential role in opiate actions, by negatively modulating MOR downstream signaling as well as the rate of MOR endocytosis.

Background Regulator of G protein signaling 4 (RGS4) is one of the smaller members of the RGS family of proteins, which are known to control signaling amplitude and duration via interactions with G protein α subunits or other signaling molecules. Earlier evidence suggests dynamic regulation of RGS4 levels in neuronal networks mediating actions of opiates and other drugs of abuse, but the consequences of RGS4 actions in vivo are largely unknown. Methods In this study, we use constitutive and nucleus accumbens-inducible RGS4 knockout mice, as well as mice overexpressing RGS4 in the nucleus accumbens via viral mediated gene transfer, to examine the influence of RGS4 on behavioral responses to opiates. We also use electrophysiology and immunoprecipitation assays to further understand the mechanisms underlying the tissue-specific actions of RGS4. Results Inducible knockout or selective overexpression of RGS4 in the nucleus accumbens reveals that, in this brain region, RGS4 acts as a negative regulator of morphine reward, while in the locus coeruleus RGS4 opposes morphine physical dependence. In contrast, we show that RGS4 does not affect morphine analgesia or tolerance, but is a positive modulator of certain opiate analgesics, such as methadone and fentanyl. Conclusions These findings provide fundamentally novel information concerning the role of RGS4 in the cellular mechanisms underlying the diverse actions of opiate drugs in the nervous system.

Spinophilin, a dendritic spine-enriched scaffold protein, modulates synaptic transmission via multiple functions mediated by distinct domains of the protein. Here, we show that spinophilin is a key modulator of opiate action. Knockout of the spinophilin gene causes reduced sensitivity to the analgesic effects of morphine and early development of tolerance but a higher degree of physical dependence and increased sensitivity to the rewarding actions of the drug. At the cellular level, spinophilin associates with the mu opioid receptor (MOR) in striatum and modulates MOR signaling and endocytosis. Activation of MOR by opiate agonists such as fentanyl and morphine promotes these events, which feedback to suppress MOR responsiveness. Our findings support a potent physiological role of spinophilin in regulating MOR function and provide a potential new target for the treatment of opiate addiction.

ΠΕΡΙΛΗΨΗ iii 1.10. Ερευνητικός σκοπός 38 2. ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ 40 2.1 Μοριακές μέθοδοι 41 2.1.1. Δημιουργία βακτηρίων μετασχηματισμού (competent cells) 2.1.2. DNA κατασκευές 2.1.3. Μετασχηματισμός βακτηρίων DH10B της E. coli (transformation) 2.1.4. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA από βακτηριακές καλλιέργειες μικρής κλίμακας (miniprep procedure) 2.1.5. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA από βακτηριακές καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας (large scale plasmid DNA preparation) 2.1.6. Ηλεκροφόρεση DNA σε πήκτωμα αγαρόζης 2.1.7. Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) 2.2. Κυτταρικές μέθοδοι 2.2.1. Κυτταρικές σειρές-πρωτογενείς καλλιέργειες 2.2.2. Παροδική διαμόλυνη ευκαρυωτικών κυττάρων 2.2.3. Ανοσοφθορισμός 2.3. Βιοχημικές μέθοδοι 2.3.1. Μέθοδος προσδιορισμού συγκέντρωσης πρωτεϊνών 2.3.2. Πειράματα ανοσοκατακρίμνησης 2.3.3. Ανάλυση πρωτεϊνών κατά Western σε πηκτή πολυακρυλαμίδης (SDS-PAGE) 2.3.4. Ανοσοενυμική μέθοδος (ELISA) 2.3.5. Βιοτυνυλίωση 2.4. Πειραματόζωα 2.4.α Hot plate assay 59 2.4.β. Υπερέκφραση της RGS9 με in vivo έγχυση ιού 60 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 61 3. Τα RGS9 διαγονιδιακά ζώα, είναι πιο ευαίσθητα στις αναλγητικές ιδιότητες της μορφίνης 3.1. Μελέτες με χρήση in vivo πειραματικών μοντέλων 3.1.1. Η RGS9 ρυθμίζεται στον επικλινή πυρήνα αποκλειστικά από τη μορφίνη 3.1.2. Η υπερέκφραση της RGS9-2 αναστέλλει την ενδοκύττωση του μ υποδοχέα που επάγεται από τη χορήγηση DAMGO 3.1.3. Η διανομή της RGS9-2 στο κύτταρο επηρεάζεται από τη χορήγηση οπιοειδών 63 3.1.4.α & β Το DEP τμήμα είναι απαραίτητο για την επίδραση της RGS9-2 στην ενδοκύττωση του υποδοχέα 3.1.4.γ.1 Χρήση ELISA σε PC12 κύτταρα για ποσοτικοποίηση ενδοκύττωσης μ υποδοχέων 3.1.4.γ.2. Χρήση βιοτυνιλίωσης σε PC12 κύτταρα για ποσοτικοποίηση ενδοκύττωσης μ υποδοχέων 3.1.5.α & β Η RGS9 αναστέλλει την ενδοκύττωση του μ υποδοχέα που επάγεται από τα οπιοειδή, σε πρωτογενείς καλλιέργειες ινοβλάστων 3.1.5.γ. Χρήση ELISA σε εμβρυϊκούς ινοβλάστες για ποσοτικοποίηση ενδοκύττωσης μ υποδοχέων 3.1.6. Η RGS9-2 εμποδίζει τη ρύθμιση τη φωσφορυλίωσης της ERK1/ERK2 από τους ενεργοποιημένους μ οπιοειδείς υποδοχείς in vitro 3.1.7. Αλληλεπίδραση της RGS9-2 με τον μ υποδοχέα των οπιοειδών και την β-αρρεστίνη 2 68 3.2. α & β Επιδράσεις στην φωσφορυλίωση της ERK1/2 και της PLCβ3 από τη χορήγηση μορφίνης ή φαιντανύλης, στον επικλήνη πυρήνα και στο ραχιαίο ραβδωτό 69 3.3.1.1. Μελέτες ανοσοκατακρίμνησης κατόπιν οξείας χορήγησης οπιοειδών 3.3.1.1.α & β Αλληλεπιδράσεις του μ υποδοχέα με σημαντικά σηματοδοτικά μόρια. 3.3.1.1.γ,δ &ζ Αλληλεπιδράσεις της RGS9 πρωτεΐνης με σημαντικά μόρια που συμμετέχουν στο σηματοδοτικό μονοπάτι κάτωθεν της διέγερσης του MOR 3.3.2. Η εφάπαξ χορήγηση μεθαδόνης ευνοεί την αλληλεπιδράσεις που δημιουργούνται μετά τη διέγερση του υποδοχέα από φαιντανύλη 3.4. Μελέτες ανοσοκατακρίμνησης κατόπιν χρόνιας χορήγησης οπιοειδών 3.4.1.α & β Αλληλεπιδράσεις της RGS9 και του μ υποδοχέα με σημαντικά σηματοδοτικά μόρια