Gyroxin is a serine protease enzyme component of the South American rattlesnake (Crotalus durissus terrificus) venom. This toxin displays several activities, including the induction of blood coagulation (fibrinogenolytic activity), vasodilation and neurotoxicity, resulting in an effect called barrel rotation. The mechanisms involved in this neurotoxic activity are not well known. Because gyroxin is a member of a potentially therapeutic family of enzymes, including thrombin, ancrod, batroxobin, trypsin and kallicrein, the identification of the mechanism of gyroxin's action is extremely important. In this study, gyroxin was isolated from crude venom by affinity and molecular exclusion chromatography. Analysis of the isolated gyroxin via sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) revealed a single protein band with a molecular weight of approximately 28 kDa, confirming the identity of the molecule. Furthermore, intravenous administration of purified gyroxin (0.25 μg/g of body weight) to mice resulted in symptoms compatible with barrel rotation syndrome, confirming the neurotoxic activity of the toxin. Mice treated with gyroxin showed an increase in the concentration of albumin-Evans blue in brain extracts, indicating an increase in the blood-brain barrier (BBB) permeability. This gyroxin-induced increase in BBB permeability was time-dependent, reaching a peak within 15 min after exposure, similar to the time span in which the neurotoxic syndrome (barrel rotation) occurs. This work provides the first evidence of gyroxin's capacity to temporarily alter the permeability of the BBB.
BackgroundSince ionizing radiation has the potential to alter the molecular structure and affect the biological properties of biomolecules, it has been successfully employed to attenuate animal toxins. The present study aimed to characterize the structural modifications on irradiated crotamine, a toxin from Crotalus durissus terrificus venom, using circular dichroism (CD), fluorescence, Fourier transformed infrared spectroscopy (FTIR), atomic force microscopy (AFM) and differential scanning calorimetry (DSC).MethodsA combination of size exclusion and ion-exchange chromatography was used to purify the peptide using crude venom. The pure toxin was then submitted to 2 kGy gamma irradiation doses from a cobalt-60 source. Native and irradiated crotamine were analyzed using a fluorescence spectrophotometer. Wavelength was fixed at 295 nm and fluorescence emission scans were collected from 300 to 400 nm. CD and FTIR techniques were used to identify the secondary structure of both samples. DSC analyses were performed at a starting temperature of 20 °C up to a final temperature of 90 °C. AFM provided a 3D profile of the surfaces of both crotamine forms adsorbed on mica.ResultsFluorescence spectroscopy showed that the quantum yield of the irradiated form decreased. CD spectra of native and irradiated crotamine solutions showed differences between the samples in wavelength, indicating that irradiation induced a transition of a small portion of the random coil regions towards an α-helical conformation. FTIR and CD showed that the native and irradiated crotamine spectra were different with regard to secondary structure. The thermodynamic analysis showed that irradiation caused changes in the calorimetric profile and CD showed that temperature-induced changes also occur in the secondary structure. Finally, AFM showed the possible formation of insoluble aggregates.ConclusionsOur results indicate that irradiation leads to progressive changes in the structure of the toxin, which could explain a decrease in myotoxic activity.
Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do Grau de Mestre em Ciências na Área de Tecnologia Nuclear -Aplicações Orientadora: Dra. Nanci do Nascimento SÃO PAULO 2010 Dedico este trabalho à minha família: meus pais, Antonio e Sonia, e meu irmão Danilo. Segue a certeza de que sem vocês eu nada seria. AGRADECIMENTOS Primeiramente a Deus, porque nada aconteceria sem esta luz. À Dra. Nanci do Nascimento, minha orientadora, pelo apoio constante, pela amizade e confiança, pelos momentos de descontração e sobretudo por ser um exemplo de simplicidade a ser seguido. Ao amigo Patrick Jack Spencer pela ajuda constante no laboratório, por todas as sugestões e conversas. A sua sabedoria certamente tornou este trabalho melhor. Ao Dr. Daniel Carvalho Pimenta pelas dicas e sugestões dadas no seminário de área e por se mostrar sempre disposto a ajudar. Ao amigo Dr. Murilo Casare da Silva pelas diversas vezes que me auxiliou, mesmo de longe, compartilhando idéias e sugestões para o desenvolvimento deste trabalho. À Dra. Maria Teresa C. Ribela pelas dicas no seminário de área. Ao amigo José Alberto Alves da Silva, Tinho, pelo seu característico senso de humor e por ser um excelente amigo. À amiga Janaína Baptista Alves por todos os ensinamentos e carinho nesses dois anos de convivência. À amiga Natália Malavasi por toda ajuda, pelas conversas e desabafos, e por sempre tornar o ambiente a sua volta muito mais divertido. À amiga Larissa Pereira Miranda pela ajuda, conversas, risadas e por ser esta pessoa tão especial. À amiga Danielle Borim por ser uma pessoa maravilhosa e, mesmo em tão pouco tempo de convívio, ter se tornado uma pessoa muito querida. Ao amigo Felipe Guimarães Albero por toda ajuda incondicional, grande amizade e especialmente pelos experimentos de FTIR. Às amigas Keli, Juliana e Rosa, por todas as risadas e momentos descontraídos. Aos amigos Johnny e José Maria por estarem presentes nos momentos de desespero e pelos momentos divertidos. Às amigas Taís, Renata e Beatriz por tantas conversas, momentos engraçados e pelo carinho. Às meninas Geyza, Eliza, Miriam, Fernanda e Claudinha pelos diversos momentos compartilhados. Às amigas Dani e Stefany pelos momentos de descontração e pelas divertidas histórias no Rio de Janeiro. Aos amigos Rodrigo, Vicente e Tamara por vários momentos de descontração na nossa salinha de estudo, bagunça e risadas. À amiga Erika Yumi por compartilhar comigo diversos momentos importantes. Aos amigos Marcos Antonio Júnior e Eduardo de Moura, por todo o auxílio prestado desde o início deste trabalho. Ao amigo Jean por várias dicas, conversas e inúmeros momentos engraçados. Aos amigos do Centro de Lasers e Aplicações, Carolina, Juca, Moisés, Thiago, Marcelo e Marcus pelos inúmeros momentos de risadas compartilhados principalmente nos congressos de Física. Aos antigos amigos por ainda fazerem parte desta caminhada. Aos demais pesquisadores e integrantes do Centro de Biotecnologia, por toda a colaboração que, com certeza, foi de grande importância no decorrer deste trabalho. Às...
Cubas de vidro (câmara muscular) utilizadas para estímulo elétrico 122 Estimulador elétrico Anexo 3: Perfil cromatográfico do veneno total de C.d.t em coluna de exclusão molecular Superdex 75, tampão formiato de amônio, 50 mM, pH 3, obtido por Casare, 2003. Anexo 4: Perfil cromatográfico do veneno total da C.d.t em coluna Superdex 75, tampão formiato de amônio, 100 mM, pH 3, obtido por Campos, 2006.
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