In the present study, a genomic DNA of MIH (GenBank: #EU869539) was cloned from the swimming crab, Portunus trituberculatus (Miers, 1876). The genome DNA, consisting of 2865 bp, is comprised of three exons interrupted by two introns. Multiple sequence alignments revealed that in the 5 upstream region of MIH, sequences with high similarity to arthropod initiator, TATA box, CREB (cyclic AMP response element binding) protein were the common structure. The signal peptide in the genomic DNA was encoded by exon1 and exon2, which was interrupted by 242 bp-intron (intron1), located between gln 12 and arg 13 . The mature peptide was encoded by exon2 and exon3, which was interrupted by 313 bp-intron (intron2), at the position between 2 nd and 3 rd nucleotides of the codon encoding arg 41 . Pot-MIH was expressed only in the eyestalk ganglia, ovaries, testes, posterior spermatic duct, bristle in ejaculatory duct, cranial ganglia, and thoracic ganglia, as determined in various tissues by semi-quantitative RT-PCR. A cDNA encoding the mature peptide was used to express recombinant MIH (rMIH) using the Escherichia coli (Migula, 1895) expression system. Two constructs were designed to yield either a mature MIH fusion protein with and without histidine (His) tag at the carboxyl terminus. The rMIH protein was detected by SDS-PAGE and Western blot analysis, indicating that the antibody prepared by two rMIH proteins has high specificity.
RÉSUMÉDans cette étude, un fragment d'ADN de MIH (GenBank : #EU869539) a été cloné à partir du crabe Portunus trituberculatus (Miers, 1876). Le génome d'ADN, de 2865 paires de bases, comprend trois exons interrompus par deux introns. Les alignements de séquences montrent que dans la région en amont du 5 de la MIH, des séquences boîte TATA, CREB (élément de fixation de réponse à l'AMP cyclique) avec une grande similitude à la protéine initiatrice d'arthropodes, ont une structure 3 ) commune. Le peptide signal de l'ADN génomique est codé par l'exon1 et l'exon2, qui est interrompu par un intron de 242 paires de base (intron1) localisé entre gln 12 et arg 13 . Le peptide mature est codé par l'exon2 et l'exon3, qui est interrompu par un intron de 313 paires de bases (intron2) positionné entre les 2 ème et 3 ème nucléotides du codon codant arg 41 . L'expression de Pot-MIH a été recherchée dans divers tissues par RT-PCR semi-quantitative et seulement trouvée dans les pédoncules oculaires, ovaires, testicules, canal spermatique postérieur, canal éjaculateur, ganglion céphalique et ganglion thoracique. Un ADNc codant le peptide mature a été utilisé pour exprimer le recombinant MIH (rMIH) en utilisant le système d'expression d'Escherichia coli (Migula, 1895). Deux construits ont été designés pour produire une MIH mature avec ou sans histidine (His) tag au niveau du carboxyl terminal. La protéine rMIH été détectée par SDS-PAGE et Western blot ce qui indique que l'anticorps préparé contre les deux protéines rMIH a une grande spécificité.