Bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs) represent an alternative to chondrocytes to support cartilage regeneration in osteoarthritis (OA). The sympathetic neurotransmitter norepinephrine (NE) has been shown to inhibit their chondrogenic potential; however, their proliferation capacity under NE influence has not been studied yet. Therefore, we used BMSCs obtained from trauma and OA donors and compared the expression of adrenergic receptors (AR). Then, BMSCs from both donor groups were treated with NE, as well as with combinations of NE and α1-, α2- or β1/2-AR antagonists (doxazosin, yohimbine or propranolol). Activation of AR-coupled signaling was investigated by analyzing ERK1/2 and protein kinase A (PKA) phosphorylation. A similar but not identical subset of ARs was expressed in trauma (α2B-, α2C- and β2-AR) and OA BMSCs (α2A-, α2B-, and β2-AR). NE in high concentrations inhibited the proliferation of both trauma and OA BMCSs significantly. NE in low concentrations did not influence proliferation. ERK1/2 as well as PKA were activated after NE treatment in both BMSC types. These effects were abolished only by propranolol. Our results demonstrate that NE inhibits the proliferation and accordingly lowers the regenerative capacity of human BMSCs likely via β2-AR-mediated ERK1/2 and PKA phosphorylation. Therefore, targeting β2-AR-signaling might provide novel OA therapeutic options.
Angiotensin II (Ang II), the main effector peptide of the renin-angiotensin system (RAS), acting on AT1 and AT2 receptors participates in the regulation of proliferation, differentiation and apoptosis in tumour cells. The peroxisome-proliferator activated receptor γ (PPARγ) and its ligands exert anti-tumour effects in various human cancer cell lines. The present study investigates the effects initiated by AT1- and AT2 receptor stimulation in SK-UT-1 cells, a human leiomyosarcoma cell line, and clarifies the role of the PPARγ in the AT2 receptor-induced differentiation and apoptosis.Selective stimulation of AT1- and AT2 receptors was achieved by incubation of the cells with Ang II (10-6 M) in the presence of the selective AT2 receptor antagonist, PD 123177 (10-6 M) and the AT1 receptor antagonist, losartan (10-5 M), respectively, the selective PPARγ antagonist, GW 9662, was used at concentration 10-6 M. The expression of smooth muscle cell differentiation markers, SM22α and calponin, was analysed at RNA- and protein levels using RT PCR and Western blot, which was also used to quantify Bcl-2-, Bax- and cleaved caspase-3 proteins. The translocation of the AT2-receptor interacting protein 1 (ATIP1) to the nuclei was studied by Western blot and immunofluorescence staining. The mitochondrial status and the metabolic activity in response to AT1- and AT2 receptor activation were assessed by the quantification of 99mTc - sestamibi and 2´-deoxy-2´-[18F]fluoro-D-glucose uptake.AT1 receptor stimulation did not exert any profound effects in quiescent SK-UT-1 cells. The effects induced by Ang II acting on AT2 receptors were time-dependent. A short, 3 - 6 h lasting stimulation promotes differentiation, i.e increases in the mRNA- and protein levels of SM22α and calponin, whereas a sustained stimulation for 48 h activates the intrinsic apoptotic pathway, as evidenced by reduced cell numbers, down-regulation of the anti-apoptotic Bcl-2 protein and increased levels of the Bax protein and cleaved caspase-3. The effects were reversed by the PPARγ antagonist, GW 9662, clearly implying a PPARγ-dependent mechanism. Our results also demonstrate a co-localisation of the AT2-receptor interacting protein, ATIP1, and the PPARγ in nuclei of SK-UT-1 cells and an accumulation of ATIP1 in the nuclear fraction in response to AT2 receptor stimulation. The regulation of the differentiation and apoptosis via the AT2 receptor favours an important functional role of this receptor in quiescent, slow-cycling SK-UT-1 cells and provides the rationale for the use of AT1 receptor antagonists for the treatment of human leiomyosarcomas.
Mesenchymale Knochenmarksstammzellen (engl. Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells (BMSCs)) sind hochproliferative multipotente Progenitorzellen mit einem hohen Regenerationspotential. Sie können aus dem Knochenmark in geschädigte Knorpelareale migrieren und dort zu Chondrozyten differenzieren. Somit können sie zur Reparatur traumatisch oder osteoarthrotisch bedingter Knorpelschäden beitragen. In verschiedenen Bereichen des Gelenks konnten zudem sympathische Nervenfasern sowie der sympathische Neurotransmitter Noradrenalin (NE) nachgewiesen werden. NE inhibiert die chondrogene Differenzierungskapazität von BMSCs und kann so zur Pathogenese der Osteoarthrose (OA) beitragen. Unbekannt ist zum derzeitigen Zeitpunkt, inwiefern NE die Proliferation von humanen BMSCs beeinflusst. Ziel unserer Studie war, den Einfluss von NE auf die Proliferationskapazität humaner BMSCs zu untersuchen und beteiligte intrazelluläre Signalwege zu identifizieren. Zu diesem Zweck wurden BMSCs von Patienten nach stattgehabtem Gelenktrauma (Trauma BMSCs) und von Patienten mit diagnostizierter OA (OA BMSCs) untersucht. Zunächst erfolgte eine Analyse des Genexpressionsmusters der verschiedenen Adrenorezeptoren (ARs). Anschließend wurden sowohl Trauma als auch OA BMSCs mit NE in unterschiedlichen Konzentrationen sowie mit NE in Kombination mit verschiedenen AR-Antagonisten (Doxazosin (α1), Yohimbin (α2) oder Propranolol (β2)) behandelt. Die Aktivierung der AR-gekoppelten Signalwege wurde anhand der Phosphorylierung der beiden Hauptsignalwege der extrazellulären signalregulierten Kinasen 1/2 (ERK1/2) und der Proteinkinase A (PKA) via Western Blot untersucht. Die Genexpression diverser AR-Subtypen konnte in Trauma (α2B-, α2C- und β2-AR) und OA BMSCs (α2A-, α2B- und β2-AR) nachgewiesen werden. Die Behandlung mit NE in hohen Konzentrationen führte zu einer statistisch signifikanten Inhibition der Proliferation von Trauma und OA BMSCs. Die Behandlung mit NE in niedrigen Konzentrationen hatte hingegen keinen Einfluss auf die Proliferation von Trauma und OA BMSCs. Sowohl ERK1/2 als auch PKA wurden in Trauma und OA BMSCs nach Behandlung mit NE aktiviert. Lediglich der β2-Antagonist Propranolol konnte sowohl die Effekte auf die Proliferation als auch auf die Aktivierung von ERK1/2 und PKA aufheben. Doxazosin und Yohimbin hatten hingegen keinen signifikanten Einfluss auf die Proliferation sowie die ERK1/2- und PKA-Phosphorylierung. Unsere Untersuchungen zeigen, dass NE die Proliferation von Trauma und OA BMSCs konzentrationsabhängig inhibiert. Dieser Effekt wird vornehmlich über eine β2-AR-gekoppelte ERK1/2- und PKA-Aktivierung vermittelt. Über diesen Mechanismus kann NE das regenerative Potential von humanen BMSCs verringern und somit zur Pathogenese der OA beitragen. Über eine zielgerichtete Beeinflussung des β2-Signalweges könnten sich zukünftig neue therapeutische Optionen bei der Behandlung osteoarthrotisch oder traumatisch bedingter Knorpelschäden ergeben.
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