La subprovincia del Bajío Guanajuatense, ubicado en el Centro de México es una de las zonas agrícolas más importantes del país, lo cual ha provocado el uso de grandes volúmenes de agua. El panorama actual de Guanajuato indica un incremento, en más del triple, del uso del agua subterránea respecto a la extraída hace 30 años, usada para maximizar el rendimiento de cultivos, así como una aplicación desmedida de fertilizantes nitrogenados. Este contexto se torna más grave dado que en la zona de estudio existen problemas de sobreexplotación, abatimiento del nivel estático, y presencia de fallas y fracturas, y aunado a ello contaminación en distintos niveles de profundidad del acuífero por compuestos nitrogenados. El objetivo de este trabajo consistió en evaluar la presencia de compuestos de nitrógeno en los distintos flujos del acuífero, identificar isotópica e hidrogeoquímicamente las fuentes, sus transformaciones y los procesos relacionados con el elevado contenido de NO3 - en el agua subterránea. Con base en los resultados obtenidos de NO3 - , elementos químicos mayores, menores, traza e isótopos, se han identificado dos fuentes de contaminación; una relacionada con la agricultura y la segunda con el tratamiento de agua residual. Esto ha ocasionado que el contenido de NO3 - supere los valores permitidos por la NOM-127, de acuerdo a los datos de muestreo del 2017 y 2019, no solo en el acuífero somero también el profundo. Se llevaron a cabo dos campañas de muestreo de agua subterránea en 32 pozos urbanos y agrícolas de los municipios de Vill y JR en Guanajuato, en temporada de lluvias y de estiaje, siguiendo métodos nacionales e internacionales. Se determinaron elementos mayores, menores y algunos elementos traza, así como isotopos estables. El origen de los elevados contenidos de NO3 - es antropogénico; los valores más elevados se cuantificaron en época de estiaje. Los nitratos migran más fácilmente a través de fallas y fracturas profundas, principalmente en la zona centro-sur del área de estudio hacia el acuífero medio y posiblemente al profundo, este proceso es relevante ya que la zona es reconocida como un medio impermeable debido a la presencia de extensas capas de arcillas. Una planta de tratamiento de agua residual es un foco de contaminación, la aplicación de fertilizantes sería el otro posible foco de contaminación. La transformación de los compuestos nitrogenados pudieran afectar el comportamiento isotópico del ?18O, aunque no se descarta que podría deberse a procesos de evaporación e infiltración de agua somera. Esta información debe ser considerada ya que la presencia de nitratos en el medio pudiera poner en riesgo la salud de la población que se abastece del mismo sistema acuífero donde se desarrollan estas actividades.